不同樹脂對(duì)特殊生物樣品包埋效果的比較

楊 慧 金良韻 姬 曼 孫竹林 陳大興 趙君朋

(首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

環(huán)氧樹脂是透射電鏡生物樣品制樣過程中應(yīng)用最為廣泛的包埋劑，為制備電鏡樣品提供支撐，同時(shí)起到保護(hù)樣品超微結(jié)構(gòu)的作用。其中Epon812和Spurr樹脂是最為常用的兩種樹脂，已經(jīng)應(yīng)用幾十年之久。Epon812樹脂是應(yīng)用最為廣泛的環(huán)氧樹脂，具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，例如樹脂塊兒聚合后體積縮小較少；對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保存良好；在超薄切片制備過程中具備優(yōu)越的切割性能；超薄切片電鏡下觀察圖像呈現(xiàn)高度反差等[1]。但Epon812樹脂易吸收水分，且粘度較高，25℃下粘度為150～210cP[2]。Spon812是Epon812的直接替代產(chǎn)品，具有與Epon812相同的特點(diǎn)。與812樹脂相比，Spurr樹脂是一種粘度相對(duì)更低的樹脂，混合樹脂也只有60cP[2]，不易吸收水分，但其毒性較大，價(jià)格昂貴。Spurr樹脂包埋的樣品比Epon812更易于切片，但超薄切片鏡下觀察反差較弱[3]。有研究者建議將兩種樹脂混合使用，可達(dá)到良好的包埋效果[4]。

本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間使用Spon 812樹脂和Spurr樹脂進(jìn)行透射電鏡樣品制備后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于某些難于浸透的生物組織樣品例如中樞神經(jīng)組織中的髓鞘、糖原堆積的肝臟組織、膠原纖維豐富的血管組織，Spon 812樹脂浸透不良現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。使用Spurr樹脂包埋，解決了浸透不良的問題，但在超薄切片制備時(shí)需要使用二甲苯或氯仿對(duì)超薄切片反復(fù)熏蒸使切片展平；另外使用定向包埋板包埋的Spurr樹脂塊聚合后松脆易斷，夏天尤為明顯，樣品的超微結(jié)構(gòu)難以得到良好的保存。因此針對(duì)上述特殊樣品，本實(shí)驗(yàn)室嘗試將兩種樹脂結(jié)合使用對(duì)特殊樣品進(jìn)行浸透和包埋，通過電鏡觀察樣品超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)混合樹脂作為包埋劑使用聚合后樹脂塊硬度適中，易于超薄切片制備，樣品滲透效果良好，超微結(jié)構(gòu)清晰，圖像襯度適中，同時(shí)具有兩種樹脂的優(yōu)點(diǎn)，可作為日常樣品包埋劑使用。

1 材料和方法

1.1 固定和取材

實(shí)驗(yàn)材料為具有糖、脂代謝模型小鼠的肝臟組織、正常小鼠腦組織、血管組織。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)2.5%戊二醛和4%多聚甲醛灌注固定，取分別取肝、腦和腹主動(dòng)脈組織，肝、腦組織切成1mm3小塊，腹主動(dòng)脈切成1mm長(zhǎng)小段，采用2.5%戊二醛固定液于4℃冰箱固定2h，0.1MPB充分洗滌后待用。

1.2 組織后固定、脫水和包埋

采用濃度1%四氧化鋨對(duì)上述組織進(jìn)行后固定，溫度設(shè)置為4℃。固定后的組織經(jīng)0.1MPB緩沖液清洗、乙醇梯度脫水后分為3組。第1組，采用Spon812樹脂(SPI-02660AB)浸透和包埋；第2組；采用Spurr樹脂(SPI-02680AB)浸透和包埋；第3組采用Spon812與Spurr按照1∶1混合的樹脂進(jìn)行浸透和包埋。浸透液配制按丙酮與樹脂比例以1∶1，1∶3，各浸透1h，純樹脂浸透2h。包埋樹脂配方見表1、表2：

表1 Spon812樹脂配方

表2 Spurr樹脂配方：

按照上述配方分別配制Spon812和Spurr樹脂，然后分別取等量體積的樹脂充分混合后用于第3組樣品組織浸透和包埋。

各組樣品入包埋板后，分別加入相應(yīng)新樹脂。聚合過程和溫度設(shè)置為37℃，過夜；45℃，8h；70℃，24h。

1.3 修塊、超薄切片和染色

樹脂聚合后，包埋塊經(jīng)修塊后用Leica UC6 超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片制備，片厚75nm，超薄切片經(jīng)常規(guī)檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.4 電鏡觀察

使用日本電子JEM2100型透射電鏡觀察3組包埋樣品，拍照?qǐng)D像的條件和放大倍數(shù)相同。

2 結(jié)果

2.1 修塊和超薄切片制備比較

修塊過程中發(fā)現(xiàn)用不同樹脂制備的包埋塊硬度存在差異，SPI-Pon812樹脂塊硬度較高，修塊最為困難；Spurr樹脂塊硬度最低，容易切割；混合樹脂則硬度和韌性介于兩者之間。超薄切片制備過程中發(fā)現(xiàn)，SPI-Pon812樹脂和混合樹脂包埋樣品易于制備超薄切片，腦組織和肝臟組織超薄切片舒展平整，血管超薄切片需要氯仿熏蒸展片。Spurr樹脂包埋的組織樣品制備的超薄切片大多需要使用氯仿熏蒸展片。

2.2 電鏡觀察結(jié)果比較

肝臟組織在電鏡下可見肝細(xì)胞內(nèi)大量糖原堆積(圖1)。Spon812樹脂包埋樣品可見圖像反差最顯著，糖原聚集處可見樹脂浸透不良產(chǎn)生的小空洞；Spurr樹脂包埋樣品浸透良好，但圖像反差小，膜結(jié)構(gòu)清晰可見；混合樹脂包埋樣品浸透良好，圖像反差介于兩種樹脂單獨(dú)使用之間，超微結(jié)構(gòu)清晰程度優(yōu)于兩種樹脂單獨(dú)使用包埋樣品獲得的圖像結(jié)果。

腦組織在電鏡下可見髓鞘結(jié)構(gòu)和大量神經(jīng)纖維和突觸構(gòu)成的神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)(圖2)。Spon812樹脂包埋樣品髓鞘結(jié)構(gòu)顯著浸透不良，多見透亮空洞；突觸結(jié)構(gòu)、突觸內(nèi)小泡和膜結(jié)構(gòu)可見。Spurr樹脂包埋樣品浸透良好，圖像反差良好，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、突觸、突觸小泡等非常清晰的結(jié)構(gòu)，神經(jīng)纖維內(nèi)可見橫切或縱切的微管結(jié)構(gòu)。混合樹脂包埋樣品具有和Spurr樹脂包埋樣品相似的觀察結(jié)果，兩者觀察效果皆優(yōu)于單獨(dú)使用Spon812樹脂包埋樣品獲得的圖像。

血管組織超微結(jié)構(gòu)有明顯的分層，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜、平滑肌細(xì)胞等，含有大量膠原纖維和彈性纖維(圖3)。Spon 812樹脂包埋樣組樣品樹脂浸透不均勻，在內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜層超薄切片可見大量褶皺形成。Spurr樹脂包埋樣品組樹脂浸透均勻，超薄切片幾乎沒有褶皺形成。而混合樹脂包埋樣品組浸透良好，超薄切片偶見褶皺，不影響超微結(jié)構(gòu)的觀察，本組超薄切片拍攝圖像反差優(yōu)于Spurr樹脂包埋組。

圖1 糖脂代謝障礙模型小鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)圖像a、b圖，Spon 812樹脂包埋的肝組織超微結(jié)構(gòu)圖像，b圖為a圖局部放大，圖像反差顯著，糖原聚集處可見樹脂浸透不良產(chǎn)生的透亮空洞，如箭頭所示；可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細(xì)胞核著色較深，可見核膜。白色三角示粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，空三角示核膜，箭頭所示為空洞；c、d圖，Spon 812和Spurr樹脂聯(lián)合使用包埋的肝組織超微結(jié)構(gòu)圖像，d圖為c圖局部放大，圖像反差良好；糖原聚集處可見樹脂浸透均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體(白三角所示)和核膜結(jié)構(gòu)(空三角所示)非常清晰；e、f圖，Spurr樹脂包埋的肝組織超微結(jié)構(gòu)圖像，f圖為e圖局部放大，圖像反差較弱，糖原聚集處可見樹脂浸透均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(白三角所示)和核膜結(jié)構(gòu)(空三角所示)可見，但反差弱，不清晰。(a、c、e圖Bar=1μm，b、d、f圖Bar=0.2μm)。

圖2 正常小鼠小鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)圖像a、b圖，Spon 812樹脂包埋的腦組織超微結(jié)構(gòu)圖像，圖像整體反差顯著，a圖為髓鞘結(jié)構(gòu)，可見樹脂浸透不良產(chǎn)生的透亮空洞，如箭頭所示；b圖為高倍鏡下神經(jīng)纖維和突觸超微結(jié)構(gòu)，白色三角示突觸結(jié)構(gòu)內(nèi)的突觸小泡；c、d圖，Spon 812和Spurr樹脂聯(lián)合使用包埋的腦組織超微結(jié)構(gòu)圖像，圖像反差適中，c圖可見髓鞘結(jié)構(gòu)樹脂滲透均勻，未見空洞，d圖可見突觸超微結(jié)構(gòu)較Spon 812包埋組織的圖像結(jié)構(gòu)清晰，可見箭頭所示神經(jīng)纖維中的微管；e、f圖，Spurr樹脂包埋的腦組織超微結(jié)構(gòu)圖像，圖像反差滿意，e圖可見髓鞘結(jié)構(gòu)樹脂浸透良好，f圖可見白三角所示的突觸結(jié)構(gòu)和突觸小泡，箭頭所示為神經(jīng)纖維中橫切或縱切的微管，超微結(jié)構(gòu)清晰且精細(xì)，易于辨認(rèn)。(a、c、e圖Bar=1μm，b、d、f圖Bar=0.2μm)。

圖3 小鼠腹主動(dòng)脈血管組織超微結(jié)構(gòu)圖像a、b圖，Spon 812樹脂包埋的血管組織超微結(jié)構(gòu)圖像，b圖為a圖局部放大，在內(nèi)膜下層和內(nèi)彈性膜層可見由于樹脂滲透不均產(chǎn)生的褶皺，如箭頭所示； c、d圖，Spon 812和Spurr樹脂聯(lián)合使用包埋的血管組織超微結(jié)構(gòu)圖像，d圖為c圖局部放大，樹脂滲透較好，圖像反差良好； e、f圖，Spurr樹脂包埋的血管組織超微結(jié)構(gòu)圖像，f圖為e圖局部放大，樹脂浸透均勻，圖像反差弱于樹脂聯(lián)合使用組。(a、c、e圖Bar=2μm，b、d、f圖Bar=0.2μm)。

3 討論

用于臨床診斷、研究以及科研觀察的樣品具有復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，某些樣品在結(jié)構(gòu)組成上存在一些特殊性，需要特殊對(duì)待處理。這就與日常工作中常規(guī)進(jìn)行批量化樣品包埋處理形成矛盾，導(dǎo)致電鏡觀察時(shí)才發(fā)現(xiàn)各種問題，其中樹脂浸透不佳的問題最為多見，產(chǎn)生空洞或褶皺，影響超微結(jié)構(gòu)觀察，降低了圖片質(zhì)量。因此需要對(duì)包埋樹脂進(jìn)行一些簡(jiǎn)單易行的改進(jìn)，使其兼顧普通樣品和特殊樣品的制樣要求。

Spon 812樹脂和Spurr樹脂是透射電鏡樣品制備最為常用的兩種環(huán)氧樹脂，二者具有相似的切割性能。Spon812適用于大多數(shù)于動(dòng)物組織、細(xì)胞樣品的包埋；Spurr多用于難浸透植物樣品的包埋。Spon812樹脂包埋樣品硬度和韌性均高于Spurr，容易制備較大超薄切片，切片平整，不需要二甲苯熏蒸展片，操作難度低。但該樹脂粘度大，硬度高的特點(diǎn)也給樣品制備帶來問題，對(duì)于某些特殊樣品，如本實(shí)驗(yàn)室在工作中遇到的質(zhì)地緊密、富含髓磷脂的髓鞘板層結(jié)構(gòu)、富含彈性纖維和膠原纖維的血管結(jié)構(gòu)，以及糖原堆積的肝臟組織，都發(fā)現(xiàn)樹脂滲透效果不佳。Spurr樹脂包埋樣品浸透效果好，易于切片，超微結(jié)構(gòu)清晰精細(xì)，尤其適合作為神經(jīng)組織樣品的包埋劑使用。但經(jīng)該樹脂包埋的肝臟組織超薄切片在鏡下觀察反差較弱。另外，Spurr樹脂價(jià)格昂貴，具有較強(qiáng)毒性，夏天使用時(shí)發(fā)現(xiàn)聚合后的樹脂塊酥脆易碎，在定向包埋板中聚合的樹脂塊尤其明顯，包埋后的組織樣品超微結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響觀察。在超薄切片制備過程中發(fā)現(xiàn)，Spurr樹脂包埋樣品的超薄切片展片效果不佳，多需二甲苯或氯仿熏蒸促使超薄切片展平，長(zhǎng)期使用對(duì)操作人員的健康有不良影響。

本實(shí)驗(yàn)室將分別配制的兩種基礎(chǔ)樹脂按照1∶1體積比混合后使用可以解決特殊樣品浸透不良的問題，同時(shí)避免了Spurr樹脂單獨(dú)使用時(shí)超薄切片展片的問題。

電鏡樣品制備受環(huán)境因素影響較大，不同季節(jié)、不同濕度、不同實(shí)驗(yàn)室，均導(dǎo)致環(huán)境存在差異，不同的樣品類型也具有不同的特點(diǎn)，因此需要具體問題具體分析，有針對(duì)性的調(diào)整樹脂配比的比例來滿足特殊需求。

4 結(jié)論

將兩種樹脂按一定比例混合用于樣品包埋既可以兼具兩種樹脂各自的優(yōu)點(diǎn)，又能克服兩種樹脂各自的缺點(diǎn)。通過發(fā)揮它們的綜合優(yōu)勢(shì)，可極大地提高常規(guī)批量多種生物組織包埋的效率。對(duì)于難浸透的樣品和圖像反差小的樣品，可單獨(dú)使用Spurr或Spon 812樹脂來滿足包埋這些特殊樣品的需求。