神曲及其炮制品中5-羥甲基糠醛的含量分析

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貯藏與包裝崗位，北京 100700)

神曲(Massa Medicata Fermentata, MMF)，又名六神曲，是由辣蓼、青蒿、蒼耳、赤小豆、苦杏仁、麥麩與面粉混合均勻后，在25～28℃的溫度下發(fā)酵7天左右制作而成的曲劑[1,2]，功效為健脾和胃，消食調(diào)中，臨床上用于脾胃虛弱，飲食停滯，胸痞腹脹，小兒食積。從漢晉到明清都是脾胃氣虛證的常用藥物[3]，既可單獨使用，也可作為飲片配伍制成康兒靈顆粒[4]、胃舒康沖劑[5]等用于臨床。神曲對小鼠腸道菌群失調(diào)具有調(diào)整和保護(hù)作用[6]，可以改善小鼠的消化功能[7]，甲醇提取物可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞的活性[8]。研究認(rèn)為，蛋白酶活力和淀粉酶活力越高，神曲的質(zhì)量越好[9]。隨著神曲發(fā)酵時間的延長，噻嗪雙酮苷的含量降低，噻嗪雙酮的含量先升后降，二者的含量變化可以在一定程度上反映發(fā)酵過程及發(fā)酵品質(zhì)[10]。神曲在各地方標(biāo)準(zhǔn)中均有記載，但均未見指標(biāo)性成分的控制標(biāo)準(zhǔn)。2015版《中國藥典》則未收載神曲相關(guān)內(nèi)容。

中藥材在貯藏與包裝環(huán)節(jié)，由于貯藏時間的延長，會引起色澤的加深，導(dǎo)致5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量從無到有，從少到多，呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。如牛膝在簡易庫和冷藏庫貯藏27個月的時間內(nèi)，5-HMF含量分別升高為0月的14倍和11倍[11]。牛膝從淺黃色泛糖變成黑色時5-HMF的含量升高了近10倍[12]。五味子貯藏2年后，色澤從紅色加深為暗紅色，5-HMF的含量升高了近6倍[13]。5-HMF的含量范圍對于評價中藥材的質(zhì)量具有共性的作用。

神曲在使用時有生、炒、焦等多種炮制品。發(fā)酵的曲劑即為生神曲，清炒或者麩炒至表面棕黃色，偶有焦斑，為炒神曲。炒至表面焦黃色，內(nèi)部微黃有焦香氣時，為焦神曲[14]。這種炮制引起色澤的變化，能否通過5-HMF的含量測定來進(jìn)行質(zhì)量的評價，尚未見文獻(xiàn)報道。本實驗收集了多批生、炒、焦神曲，探討神曲炮制品、不同色澤與5-HMF含量的相關(guān)性，以期為神曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有SIL-20A型自動進(jìn)樣器，DGU-20A5型自動脫氣機，SPD-M20A型二極管陣列檢測器，LC-20AT型泵，CTD-10ASvp柱溫箱，LC-solution色譜工作站；XS105 Dual Range型電子分析天平(精度0.01 mg，Mettler Toledo儀器系統(tǒng)有限公司)；Ohaus CP224C型電子天平(精度0.1 mg，平奧豪斯(上海)儀器有限公司)；三恩馳便攜式電腦色差儀(NH310型,深圳市三恩馳科技有限公司)；DFT-50A型手提式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；KQ-100E超聲波清洗器(100 W，40 kHz)(昆山市超聲儀器有限公司)。

5-HMF對照品，純度≥99.09%(美國Sigma-Aldrich公司)；色譜純甲醇、乙腈[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。各樣品購買于藥材市場和各地的藥店，詳見表1。

1.2 方法

1.2.1色澤觀察

取各樣品適量，粉碎，過四號篩，取適量樣品粉末置于白紙上，在日光下觀察色澤，結(jié)果見表1。

表1 神曲的樣品信息、色澤、水分和5-HMF的含量

續(xù)表1

1.2.2色澤測定

測定結(jié)果見表2。

表2 各樣品的色澤測定結(jié)果

續(xù)表2

1.2.3水分測定

取“1.2.1”項下粉末約2.0 g，精密稱定，按2015版《中國藥典》通則0832項下烘干法測定水分，含量結(jié)果見表1。

1.2.45-HMF的含量測定1.2.4.1色譜條件

Dikma Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(5∶95，v/v)，檢測波長284 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4.2對照品溶液的制備

精密稱定5-HMF對照品3.97 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加80%甲醇使溶解，并加到刻度線，制成濃度為0.397 g/L的對照品溶液。

1.2.4.3供試品溶液的制備

取“1.2.1”項下粉末約1.0 g，精密稱定后，置于25 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，超聲處理25 min(100 W，40 kHz)，取出放冷至室溫，補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。供試品與對照品溶液的色譜圖見圖1。

圖1 對照品及紅參供試品HPLC圖A.對照品；B.供試品；1.5-HMF

1.2.4.4方法學(xué)考察

參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，測定了系列濃度對照品溶液中5-HMF的峰面積，以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，計算線性方程為Y=8 037 489X-20 286(r2=0.999 4)，適用的進(jìn)樣量范圍在0.001 985～0.397 μg之間。連續(xù)6次測定濃度為19.85 μg/mL的5-HMF對照品溶液，計算其峰面積的RSD為0.98%，說明該儀器的精密度良好。取19號供試品粉末6份，每份質(zhì)量約1.0 g，按照“1.2.4.3”項下所述方法進(jìn)行供試品溶液的制備，以“1.2.4.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算得5-HMF的平均含量為162.3 μg/g，RSD為1.85%，表明該方法的重復(fù)性良好。室溫下，將該供試品溶液在0、2、4、8、12、24小時分別進(jìn)樣，測定5-HMF峰面積的RSD為1.84%，說明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。按表3的稱樣量稱重，與2.0 mL濃度為39.70 μg/mL的5-HMF對照品溶液共置于具塞錐形瓶中，制備供試品溶液并測定，計算得平均加樣回收率為100.83%，RSD為2.10%，結(jié)果見表3。

1.2.4.5樣品含量測定

將按照“1.2.4.3”項下方法制備的供試品溶液，按“1.2.4.1”項下的色譜條件分別進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)一點法計算干品中的含量，結(jié)果見表1。

表3 5-HMF的加樣回收率試驗結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 色澤觀察與測定

表1的結(jié)果顯示，生神曲和炒神曲的色澤較淺，呈黃白、灰白色，兩類之間的色澤基本一致，但是焦神曲的色澤較深，為黃褐色，與生、炒神曲的色澤有明顯的差別。L*表示亮度，其值越大說明色澤越白，越小說明色澤越黑。結(jié)果顯示，各樣品的L*值變化較大，生神曲和炒神曲樣品中，除了2、6號樣品外，L*值均大于55；焦神曲的L*值均小于55。色差值(ΔE*)可以客觀地表示人眼區(qū)分不同樣本色澤的能力，數(shù)值越大，說明樣品色澤與對照物色澤的差異越明顯。在15份生神曲和炒神曲樣品中，除6號樣品以外，ΔE*值均低于40，焦神曲的ΔE*值均高于40。L*和ΔE*值的變化均說明焦神曲的色澤較深，而生、炒神曲色澤較淺，色差儀測定的數(shù)據(jù)與人眼觀察的結(jié)果一致。

表2的結(jié)果顯示，生神曲和炒神曲各樣品之間的ΔE*值差異不明顯。焦神曲的ΔE*值均高于生、炒神曲。這樣的色澤測定結(jié)果與人眼所見的結(jié)果一致。目前神曲炮制程度的判斷完全依賴人眼觀察，存在主觀和模糊等缺點，色差儀可以給出色澤的具體數(shù)值，且操作方便，對于神曲炮制的判斷具有重要意義，建議在神曲及其炮制品的制備時應(yīng)用客觀的色差儀進(jìn)行測定。本實驗首次在神曲及其不同炮制品中檢測出了5-HMF。

2.2 水分與5-HMF的含量測定

表1的結(jié)果顯示，各樣品的水分含量均低于10%，且變化范圍較窄。本實驗測定的各種神曲中，水分含量基本一致，說明神曲及其炮制品的水分含量是可控的和穩(wěn)定的。5-HMF的含量，在生品中的范圍為3.933～163.6 μg·g-1，平均48.68 μg·g-1；在炒神曲中的范圍為6.116～128.2 μg·g-1，平均51.08 μg·g-1；在焦神曲中的范圍為25.91～162.3 μg·g-1，平均69.36 μg·g-1。就平均值來看，生品與炒神曲的平均含量基本一致，焦神曲中的含量與生、炒神曲有明顯的升高。表1的結(jié)果顯示，神曲的生、炒、焦制品中5-HMF的含量變化很大，即使是生品中的含量也從3.933 μg·g-1到163.6 μg·g-1，最大值是最小值的41.6倍，造成這種現(xiàn)象的原因，可能與神曲特殊的發(fā)酵制作過程有關(guān)。

2.3 色澤與5-HMF含量的相關(guān)性

生神曲、炒神曲兩類的色澤基本一致，焦神曲的色澤明顯加深。相對應(yīng)的，5-HMF的平均含量在生神曲、炒神曲中基本一致，在焦神曲中明顯升高。色澤與5-HMF含量之間具有完全對應(yīng)的相關(guān)性。說明神曲在炮制過程中，隨著溫度的升高和時間的延長，引起色澤的加深和5-HMF含量的升高。

在19份神曲樣品中，有7份來源于河北安國藥材市場不同的經(jīng)銷商，有生、炒、焦之分，色澤不盡一致，5-HMF的含量也不一致，說明神曲的質(zhì)量不統(tǒng)一。

3 結(jié)論

本實驗首次在神曲及其不同炮制品中檢測出了5-HMF。且隨著生、炒、焦神曲的色澤加深，其中5-HMF的含量也顯著升高。這種現(xiàn)象與何首烏[15]、黃精[16]炮制后引起色澤加深、5-HMF含量升高的現(xiàn)象一致。

就全國的情況來說，神曲的生產(chǎn)，不同地區(qū)所用原料及其配比不盡一致[17]，發(fā)酵過程中引入的微生物也不完全相同[18]，發(fā)酵時間等工藝參數(shù)也不一致[19]，這些因素勢必導(dǎo)致神曲產(chǎn)品質(zhì)量的不一致。因此，為了保證神曲的質(zhì)量，應(yīng)該建立全過程的質(zhì)量控制系統(tǒng)，包括辣蓼、青蒿等原料的質(zhì)量，保證各原料配伍比例的一致性，引入統(tǒng)一的神曲專用微生物，制定統(tǒng)一規(guī)范的發(fā)酵和炮制工藝，并從色澤等外觀方面控制神曲產(chǎn)品的質(zhì)量。只有這樣，才能生產(chǎn)出統(tǒng)一質(zhì)量的神曲，才可制定包括5-HMF在內(nèi)的多個指標(biāo)性成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。