豬偽狂犬病毒Real-time PCR檢測方法的建立和弱毒疫苗病毒含量的檢測

華 濤,唐 波,黃 江,常 晨,劉國陽,張雪花,侯繼波,張道華*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014;3.省部共建國家重點實驗室培育基地/江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室,江蘇 南京 210014;4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

豬偽狂犬病(Pseudorabies, PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的一種以豬發(fā)熱、呼吸障礙、流產(chǎn)和腦脊髓炎等為癥狀的急性傳染病,嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)[1]。PRV屬皰疹病毒科、-皰疹病毒亞科,基因組為150 kb的雙股DNA病毒[1]。2011年以后偽狂犬病毒變異嚴(yán)重,使我國的疫情更加嚴(yán)重[2]。PRV疫苗免疫是預(yù)防偽狂犬病最有效的方法,目前我國市場上主要使用的疫苗是BarthaK-61gE基因缺失活疫苗,一些研究顯示其對我國流行毒株的保護力較經(jīng)典強毒疫苗低[2-3];但隨著研究的深入，Bartha K-61活疫苗對流行毒株同樣也有保護效果[4-5]。目前我國生產(chǎn)PRV活疫苗有50多家企業(yè),不同企業(yè)生產(chǎn)的疫苗含PRV量不盡相同,為了提高弱毒疫苗的免疫效果,很多企業(yè)將弱毒疫苗配苗標(biāo)準(zhǔn)提高到大于5000 TCID50/頭份的國家標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。

PRV基因組含有眾多的基因,其中g(shù)B基因在野毒和疫苗株中高度保守,其作為PRV的必需基因參與病毒的感染和復(fù)制,缺失后病毒喪失感染性,且其也是病毒重要的保護性抗原,參與誘導(dǎo)免疫保護[8]。因此可以用gB基因序列建立檢測疫苗含量的PCR方法,或用表達的蛋白建立免疫抗體的血清學(xué)檢測方法。實時熒光定量PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于很多病毒的檢測,不僅可以對檢測的序列進行定性分析,而且可以對其進行準(zhǔn)確定量,與常規(guī)PCR技術(shù)相比有更高的敏感性、特異性和更好的重復(fù)性,具有快速和污染幾率低等優(yōu)點[9]。本實驗采用SYBR Green建立了一種PRV實時熒光定量檢測方法,以期為PRV活疫苗含量的定量分析提供一種簡便快速、經(jīng)濟和靈敏的檢測方法。本文還利用這種方法對不同病毒滴度的病毒液進行檢測,再與CPE法測出的病毒滴度進行比較分析,研究了熒光定量PCR檢測PRV病毒滴度的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

BHK-21細胞和PRV Bartha-K61病毒由本實驗室保存;小牛血清、DEME細胞培養(yǎng)液購自Gibico; SYBR Premix Ex Taq、rTaq聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白酶K、BamHⅠ和KpnⅠ等購自寶生物; Gel Extraction Kit 200凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega; 7種PRV活疫苗購自疫苗經(jīng)銷商或由豬場贈送。

1.2 實驗儀器

Takara PCR儀器、TANON電泳儀、TANON電泳圖像分析系統(tǒng)、Thermo超微量分光光度計NanoDrop 1000、Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀。

1.3 gB基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

根據(jù)JS-2012(KP257591.1)gB基因序列,用Primer 5設(shè)計上游和下游引物，其中g(shù)B up為5′-GCGTCGGGGTCCTCGCTCT-3′，gB down為5′-CACGTGAACGACATGCTGA-3′。PCR反應(yīng)體系: Bartha-K61的DNA模板5 μL、dNTP 4 μL、MgCl23 μL、rTaq 0.5 μL、buffer 25 μL、上游和下游引物各1 μL,用H2O補足至50 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,68 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR完成后回收gB基因,連入pMD 18T,經(jīng)酶切和測序正確后命名為pMD-gB。標(biāo)準(zhǔn)品用NanoDrop 1000檢測質(zhì)粒濃度,計算并稀釋到1×1010拷貝/μL,經(jīng)10倍稀釋后于-20 ℃保存。

1.4 熒光定量PCR的建立

對Genbank中多株P(guān)RVgB基因進行比對分析,采用Primer 5軟件在gB基因保守區(qū)設(shè)計引物,P-F:5′-GTCACCCGCGTGCTGATCGTCT-3′；P-R:5′-GGCAACCACCGGCGCTACTTT-3′。用pMD-gB質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)10倍梯度稀釋成1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/μL,進行定量PCR；以起始模板數(shù)的對數(shù)為X軸,以Ct值為Y軸做回歸曲線,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系: SYBR 10 μL、上游和下游引物各0.4 μL、模板2 μL，用H2O補足至20 μL。用Roche LightCycler 480進行反應(yīng)。程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,共40個循環(huán);40 ℃ 30 s。溶解曲線程序：95 ℃ 5 s,65 ℃ 15 s,97 ℃ 5 s。

1.5 熒光定量PCR的重復(fù)性實驗

采用該熒光定量PCR方法,分別選取1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測,進行3次批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗,來檢驗本方法的重復(fù)性。

1.6 特異性

采用該熒光定量PCR方法對PCV2、PPV、JEV、PRRSV、CSFV等常見豬源病毒的DNA或cDNA進行定量PCR擴增,檢測該方法的特異性。

1.7 敏感性

選取1×109～1×102拷貝/μL共8個濃度梯度進行實時熒光定量PCR反應(yīng),并按以上濃度梯度進行常規(guī)PCR反應(yīng),觀察熒光定量PCR反應(yīng)和常規(guī)PCR反應(yīng)的敏感性差異。

1.8 病毒DNA的提取和檢測

采用配套稀釋液稀釋送檢疫苗,取病毒液450 μL，加入50 μL 10%SDS和3 μL蛋白酶K,在56 ℃下作用30 min。采用酚∶氯仿法提取病毒DNA,加入30 μL H2O溶解。將108TCID50/mL的PRV Bartha-K61病毒連續(xù)進行10倍稀釋,取450 μL不同稀釋度的病毒液按以上方法提取DNA。用已優(yōu)化的熒光定量PCR檢測方法對樣品進行檢測,將樣品的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比對,所得結(jié)果即為對應(yīng)病毒液中病毒基因組的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 gB基因標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的制備

在PCR反應(yīng)后進行電泳，發(fā)現(xiàn)了1154 bp的gB基因片段(圖1A)。將gB片段連入pMD18-T,用內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定,結(jié)果表明1154 bp為gB片段,2700 bp為pMD 18-T載體,鑒定正確(圖1B)。測序后將該陽性質(zhì)粒命名為pMD-gB。

圖1 gB基因常規(guī)PCR擴增(A)和pMD-gB質(zhì)粒BamHⅠ和KpnⅠ酶切鑒定結(jié)果(B)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒1×109～1×105拷貝/μL濃度按熒光定量PCR反應(yīng)進行擴增,得到擴增曲線(圖2A)。用Roche Light Cycler 480分析軟件進行數(shù)據(jù)分析,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2B),拷貝數(shù)的對數(shù)值(X軸)與Ct值(Y軸)之間的線性關(guān)系為Y=-3.232X+40.56。溶解曲線(圖2C)表明該產(chǎn)物的TM值在87.5 ℃左右。

2.3 重復(fù)性實驗

檢測熒光定量PCR方法的重復(fù)性,分別選取1×109、1×108、1×107、1×106、1×105拷貝/μL的質(zhì)粒樣本,進行3次批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗。結(jié)果如表1和表2所示,變異系數(shù)均小于0.5%,表明本方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表1 批內(nèi)重復(fù)性實驗結(jié)果

表2 批間重復(fù)性實驗結(jié)果

2.4 特異性實驗

用熒光定量PCR方法對PCV2、PPV、JEV、CSFV和PRRSV樣品的DNA或cDNA進行特異性分析,選用1×106拷貝/μL的pMD-gB標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品對照。結(jié)果如圖3所示,除了模板質(zhì)粒有熒光信號外,其他病毒的DNA或cDNA模板均無反應(yīng),說明本方法有較強的特異性。

1: 1×106拷貝/μL pMD-gB質(zhì)粒; 2: PCV2;3: PPV; 4: JEV; 5: CSFV; 6: PRRSV。

2.5 敏感性實驗

選取1×109～1×102拷貝/μL PRV陽性質(zhì)粒8個濃度梯度進行實時熒光定量PCR反應(yīng),該方法的最低檢出濃度為1×103拷貝/μL(圖4)。常規(guī)PCR反應(yīng)的最低檢出濃度為1×105拷貝/μL(圖5)。表明該實時熒光定量PCR的敏感性比常規(guī)PCR高100倍。

2.6 病毒滴度與基因拷貝數(shù)的關(guān)系

用Bartha-K61病毒接種96孔板中的BHK-21細胞,觀察細胞形態(tài)變化,用Karber法計算病毒滴度。提取病毒的DNA,用實時定量PCR確定病毒的基因拷貝數(shù)。結(jié)果顯示：108、107、106、105和104TCID50/mL病毒液的基因拷貝數(shù)分別為9.82×1011、1.32×1011、1.24×1010、1.34×109、1.27×108拷貝/mL。將不同病毒滴度的對數(shù)和病毒基因拷貝數(shù)的對數(shù)進行線性回歸分析,結(jié)果見圖6。病毒基因拷貝數(shù)的對數(shù)與病毒滴度TCID50的對數(shù)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.978x+4.216,其中y=lg(拷貝數(shù)/mL),x=lg(TCID50/mL),相關(guān)系數(shù)R2=0.9993,說明兩者間有較好的相關(guān)性。

圖4 實時熒光定量PCR的敏感性實驗結(jié)果

2.7 商品PRV活疫苗的檢測

從7種商品PRV弱毒活疫苗中提取病毒DNA,用熒光定量PCR檢測gB基因的含量,計算7種弱毒活疫苗中的gB基因拷貝數(shù)，并采用病毒滴度與基因拷貝數(shù)回歸方程計算病毒滴度。結(jié)果顯示,疫苗A和C的每頭份PRV病毒gB基因拷貝數(shù)明顯高于其他5種活疫苗的,說明不同廠家生產(chǎn)的PRV弱毒活疫苗病毒含量存在明顯的差異。

3 討論

豬偽狂犬病是危害中國當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要疫病之一,PRV的gE基因缺失弱毒疫苗免疫是預(yù)防偽狂犬病最有效的方法[1]。2011以來PRV在中國豬場廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失,雖然有些豬場進行了疫苗接種,但由PRV造成的新生仔豬神經(jīng)癥狀乃至死亡時有發(fā)生[2]。疫苗的質(zhì)量可能是其原因之一,評價疫苗的參數(shù)很多,其中弱毒苗含量是非常重要的參數(shù)[6-7]。已知PCR技術(shù)能直接檢測病毒種類,特別是熒光定量PCR能夠快速定量檢測疫苗劑量。利用熒光定量PCR技術(shù)對疫苗劑量進行使用前的檢測,可以明顯加快疫苗質(zhì)量檢測,比細胞檢測病毒滴度更加快捷方便[10-12]。

表3 PRV弱毒活疫苗的病毒含量檢測結(jié)果

M: DL2000 Marker；1～6：pMD-gB質(zhì)粒的濃度分別為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105和1×104拷貝/μL。

圖6 用CPE法檢測出的PRV滴度與用熒光定量PCR法測得的基因組拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系

熒光定量PCR檢測樣品首先要構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,最為常見的建立DNA標(biāo)準(zhǔn)品的方法是向質(zhì)粒載體中克隆一種病毒的基因序列。PRV的gB基因為2.8 kb,比其他基因保守,是PRV野毒株和基因缺失疫苗毒株的組分之一[8]。因此可以選擇gB基因序列建立檢測偽狂犬病基因缺失疫苗劑量的熒光定量PCR方法。針對PRVgB基因保守區(qū)構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,應(yīng)用SYBR Green Ⅰ建立一種可檢測PRV載量的熒光定量PCR方法。SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR相比于探針法熒光定量PCR具有成本低、應(yīng)用范圍廣、變異系數(shù)低等特點[9]。

本方法采用gB基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行熒光定量PCR,結(jié)果顯示倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線相同,間距相等。到了低拷貝數(shù)間距變小,原始濃度與Ct值有明顯的線性關(guān)系；本實驗的擴增效率為2.039,接近于最高擴增效率2。說明本實驗做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線是成功的。重復(fù)性實驗選取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品做多次重復(fù)檢測,結(jié)果顯示批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗的變異系數(shù)均小于1%,可見本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。特異性實驗結(jié)果顯示,由本實驗室保存的PCV2、PPV、JEV、CSFV和PRRSV的DNA或cDNA進行實時定量PCR擴增,結(jié)果均無特異性反應(yīng),說明本實驗對PRV有良好的特異性。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),被測樣品中原始目的基因的含量和PCR擴增產(chǎn)物的量有良好的對應(yīng)關(guān)系,因此能通過對擴增產(chǎn)物的含量分析來反映被測病毒的實際含量[10-12]。在對多種病毒的研究中,熒光定量PCR檢測病毒滴度已經(jīng)得到應(yīng)用,如腺病毒[10]、慢病毒[11]、桿狀病毒[12]等。本實驗對用熒光定量PCR法檢測的PRV病毒基因拷貝數(shù)和用CPE法檢測的PRV滴度進行了線性回歸分析,相關(guān)系數(shù)為0.9993,說明兩者間存在良好的相關(guān)性。因此,可以通過分析病毒拷貝數(shù)來確定病毒的感染滴度。2種方法比較,熒光定量PCR方法在實際應(yīng)用中,樣品從提取到檢測大約要4 h,而CPE法則需要鋪細胞板、接毒，在3～5 d后觀察，總時間達5～7 d,而且所得結(jié)果有一定的主觀性。因此,相對于CPE法，熒光定量PCR節(jié)省了大量時間,降低了測定者的主觀性,更適于大型豬場進行疫苗的快速鑒定和篩選。在成本方面,由于分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展,現(xiàn)在的試劑價格有了很大的降低,而人工成本則顯著提高,因此熒光定量PCR的成本比CPE法低。但病毒受凍融、自身半衰期等因素的影響,感染性病毒數(shù)難免要低于總病毒顆粒數(shù)。因此,綜合考慮,熒光定量PCR法檢測PRV病毒滴度更適用于豬場進行疫苗的快速檢測或新鮮病毒樣品的檢測。

PRVgE基因缺失弱毒疫苗含量是評價疫苗優(yōu)劣的重要指標(biāo),我國的弱毒疫苗配苗標(biāo)準(zhǔn)為大于5×103TCID50/頭份[6]。本實驗選用江蘇、江西和浙江地區(qū)廣泛使用的7種PRVgE基因缺失弱毒疫苗,用熒光定量PCR方法對疫苗的病毒基因拷貝數(shù)進行檢測。經(jīng)定量PCR之后,采用建立的拷貝數(shù)和病毒滴度相互關(guān)系回歸方程計算病毒滴度,結(jié)果顯示各廠家的疫苗在配苗時病毒含量均高于國家制定的標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)為各廠家在配苗時都考慮到了活疫苗的凍干、保存和凍融損失,與說明書標(biāo)識含量基本相符。但不同廠家疫苗的PRV含量仍存在明顯的差異,最高與最低含量甚至相差50倍以上,其中2種疫苗顯著高于另外5種疫苗,這2種疫苗從病毒含量來看性價比更好,可能臨床效果更好。但真實的臨床免疫效果是否存在不同,需要臨床試驗進一步確認(rèn)。

本研究建立了熒光定量PCR法來檢測PRV的gB基因含量,結(jié)果表明熒光定量PCR測定的病毒拷貝數(shù)與CPE法檢測的病毒滴度有較好的線性關(guān)系；對市售疫苗的檢測結(jié)果說明所建立的熒光定量PCR法可以快速檢測疫苗的病毒含量,具有很好的臨床參考意義。