3D打印多孔鈦金屬植入物不同孔隙率對(duì)骨長(zhǎng)入影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉路坦，牛國(guó)旗，周乾坤，陳 輝，聶 虎，王震寰

上頸椎畸形伴寰樞關(guān)節(jié)脫位或不穩(wěn)常導(dǎo)致脊髓壓迫，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。目前脊柱外科治療這種顱頸交界區(qū)疾病的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式是后路枕頸融合術(shù)，但傳統(tǒng)枕頸融合的內(nèi)植物存在置釘困難、缺乏良好解剖形態(tài)匹配、無(wú)孔隙結(jié)構(gòu)等缺陷，無(wú)法直接骨長(zhǎng)入，只能進(jìn)行植骨融合，存在融合失敗的風(fēng)險(xiǎn)[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)對(duì)骨長(zhǎng)入有積極的促進(jìn)作用，并利用3D打印技術(shù)設(shè)計(jì)制造多孔植入物來(lái)解決骨長(zhǎng)入問(wèn)題[2-3]。我院脊柱外科團(tuán)隊(duì)利用3D打印等數(shù)字醫(yī)學(xué)技術(shù)，研制出一款集固定、置釘、融合為一體的3D打印個(gè)體化枕頸融合器(專利號(hào)：ZL201721220260.5)，并將其骨接觸面設(shè)計(jì)為仿骨小梁的多孔結(jié)構(gòu)。但這種多孔結(jié)構(gòu)與顱骨、頸椎后弓表面皮質(zhì)骨能否像3D打印多孔髖臼杯一樣獲得良好骨長(zhǎng)入，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，我們利用兔長(zhǎng)骨皮質(zhì)骨模擬顱骨與頸椎后弓皮質(zhì)骨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在探討3D打印多孔鈦板能否與處理后的皮質(zhì)骨表面形成有效骨長(zhǎng)入從而獲得融合，并確定適宜骨長(zhǎng)入的孔隙率，為3D打印枕頸融合器在骨性融合方面提供理論支持?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康新西蘭大白兔18只，兔齡6～8個(gè)月，雌雄不限，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0011；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：No 201803587]，分籠飼養(yǎng)。3D打印多孔鈦板(北京愛(ài)康公司提供打印)，3D打印機(jī)(上海復(fù)志公司)，硬組織切片機(jī)(德國(guó)艾卡特公司)，硬組織磨片機(jī)(德國(guó)EXAKT公司)，螺旋CT、X光機(jī)(德國(guó)西門(mén)子公司)。10%水合氯醛，VG染液(上海己博公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔股骨干模型的重建及打印 使用64排螺旋CT對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行0.5 mm層厚連續(xù)薄層掃描，將掃描的股骨干數(shù)據(jù)以DICOM格式文件導(dǎo)出，并使用三維重建軟件Mimics 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重建。將股骨干3D模型數(shù)據(jù)傳導(dǎo)入ideaMaker軟件進(jìn)行切片，切片完成后傳入3D打印機(jī)進(jìn)行模型打印。

1.2.2 多孔金屬鈦板的設(shè)計(jì) 測(cè)量股骨干3D模型的直徑、長(zhǎng)度等參數(shù)。根據(jù)兔股骨干形態(tài)和所測(cè)參數(shù)設(shè)計(jì)多孔鈦板形狀及尺寸：主體形狀為長(zhǎng)方形，長(zhǎng)10 mm，寬5 mm，厚2 mm，螺孔Φ2.4 mm。鈦板主體結(jié)構(gòu)分為兩層，即骨接觸面多孔層(厚度1.4 mm)和非骨接觸面層(厚度0.6 mm)，孔徑600 μm，孔隙率分為35%、55%和75%。最后利用電子束融化法進(jìn)行打印(見(jiàn)圖1、2)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模 實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為A、B、C組，各6只，分別植入35%、55%、75%孔隙率的3D打印多孔鈦板。術(shù)前備皮，禁食、水12 h，術(shù)前30 min青霉素肌肉注射預(yù)防感染。10%水合氯醛溶液(2.0 mL/kg)耳緣靜脈麻醉。常規(guī)消毒，鋪巾。取股骨中段前外側(cè)3.0 cm縱行切口，鈍性分離股骨外側(cè)肌群，通過(guò)肌間隙顯露股骨干。取股骨干中段前外側(cè)1 cm×2 cm骨面作為置板區(qū)域，以磨鉆小心打磨骨皮質(zhì)至出現(xiàn)新鮮點(diǎn)狀滲血。使用1.0 mm克氏針在打磨區(qū)均勻鉆孔，微孔間距2～3 mm。將3D打印多孔鈦板放置妥當(dāng)后使用2.4 mm鎖定螺釘固定。反復(fù)沖洗切口，逐層縫合。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材與處理 術(shù)后第4、16周，分別從3組實(shí)驗(yàn)兔中選取3只，處死后取出股骨并仔細(xì)剝離周圍軟組織，用于大體觀察、影像學(xué)觀察。依次對(duì)股骨干標(biāo)本進(jìn)行4%多聚甲醛組織固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、甲基丙烯酸甲酯包埋處理，然后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行切割和打磨拋光處理,切片厚度控制在50 μm左右，最后進(jìn)行VG染色處理，用于組織學(xué)觀察。

1.3 觀察指標(biāo) 大體觀察：觀察植入鈦板周圍是否有骨膜包被，鈦板與股骨干之間是否有骨組織生成以及與鈦板結(jié)合情況。影像學(xué)觀察：通過(guò)X線片觀察植入鈦板位置及鈦板周圍是否有骨痂形成，鈦板與骨面之間是否有縫隙。組織學(xué)觀察：鏡下觀察各標(biāo)本多孔結(jié)構(gòu)中是否有新生骨組織，并采集圖像信息(每個(gè)標(biāo)本2張)，用Image-pro Plus 6.0軟件對(duì)新生骨組織面積進(jìn)行半定量分析，計(jì)算新生骨形成率，新生骨形成率=新生骨組織面積/多孔鈦板內(nèi)部可供骨長(zhǎng)入孔隙的總面積×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)兔大體觀察結(jié)果 各標(biāo)本植入的多孔鈦板均固定在位，未見(jiàn)明顯移位現(xiàn)象。術(shù)后4周，各組標(biāo)本鈦板周圍及與骨面間可見(jiàn)纖維組織，未見(jiàn)明顯骨痂形成。術(shù)后16周，各組標(biāo)本鈦板和骨面之間有新生骨組織形成連接，鈦板周圍有較多的骨痂形成，個(gè)別鈦板被骨痂包裹(見(jiàn)圖3)。

2.2 實(shí)驗(yàn)兔影像學(xué)觀察結(jié)果 X線片觀察顯示，各組鈦板均固定在位。術(shù)后4周多孔鈦板與骨質(zhì)之間無(wú)明顯骨痂形成，部分鈦板與骨面之間存在有一定間隙。術(shù)后16周鈦板周圍均有不同程度的骨痂形成，部分鈦板被骨痂包繞，鈦板與骨面結(jié)合緊密，未見(jiàn)明顯間隙(見(jiàn)圖4)。

2.3 組織學(xué)觀察 術(shù)后16周，A組實(shí)驗(yàn)兔鈦板邊緣可見(jiàn)骨組織長(zhǎng)入，但由于孔隙率過(guò)低，各孔隙之間空間較小，孔隙內(nèi)部骨長(zhǎng)入欠佳；B組可見(jiàn)一定量的新骨生成并長(zhǎng)入孔隙之中，但骨組織與鈦板之間存在一定縫隙，骨-植入物界面骨結(jié)合不良，易發(fā)生微動(dòng)影響遠(yuǎn)期穩(wěn)定性；C組鈦板孔隙間空間適宜，各孔隙互有聯(lián)通，新生骨組織長(zhǎng)入孔隙內(nèi)部，長(zhǎng)入密度較高，且與鈦板結(jié)合緊密(見(jiàn)圖5)。3組新生骨形成率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中C組均明顯高于A組和B組(P<0.01)，B組亦明顯高于A組(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 3組實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后16周新生骨形成率比較

q檢驗(yàn)：與A組比較**P<0.01;與B組比較##P<0.01

3 討論

鈦金屬具有密度低、強(qiáng)度高、耐腐蝕、生物力學(xué)性能和生物相容性好的特點(diǎn)，是目前已知生物親和力最好的金屬。其彈性模量較其他金屬更接近人體骨骼的彈性模量，成為目前骨科內(nèi)植物材料的優(yōu)先選擇[4]。常規(guī)鈦植入物表面光滑，內(nèi)部無(wú)孔隙結(jié)構(gòu)，只能單純被纖維組織包裹，主要依賴與宿主骨骼之間的摩擦力和來(lái)自螺釘鈦纜的第三方固定來(lái)保持穩(wěn)定，無(wú)法完成骨長(zhǎng)入過(guò)程[5]。為解決這一問(wèn)題，模擬骨小梁結(jié)構(gòu)的三維孔隙結(jié)構(gòu)被引入鈦植入物的制作之中，利用3D打印技術(shù)特殊的制作工藝，將鈦合金制造成多孔植入物。3D打印技術(shù)可精確控制多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率、孔徑、空間排列等參數(shù)。

多孔鈦金屬植入物有以下優(yōu)點(diǎn)[6-8]：(1)可以通過(guò)孔徑和孔隙率的調(diào)節(jié)來(lái)改變彈性模量，減少應(yīng)力屏蔽效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)植入物和宿主骨之間的力學(xué)性能的匹配；(2)增加材料比表面積和材料-骨接觸面積，促進(jìn)骨整合；(3)孔隙的存在可保持細(xì)胞形態(tài)，為成骨細(xì)胞提供黏附和增殖空間，有利于骨長(zhǎng)入；(4)孔隙之間相互聯(lián)通，有利于氧分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸以及代謝物的交換。近年多孔鈦金屬植入物從實(shí)驗(yàn)到臨床亦得到了多維度應(yīng)用。YANG等[9]對(duì)實(shí)驗(yàn)綿羊行3D打印多孔鈦合金自穩(wěn)人工頸椎置換術(shù)，組織學(xué)觀察顯示骨組織可以順利長(zhǎng)入人工椎體孔隙內(nèi)部，并能維持頸椎的穩(wěn)定性。ARANDA等[10]利用3D打印制造個(gè)體化多孔鈦胸骨，用于因胸壁腫瘤行胸骨切除后的修復(fù)，效果得到認(rèn)可。XU等[3]為一例尤文肉瘤患兒行全球首例3D打印多孔人工定制樞椎的置換，術(shù)后恢復(fù)良好。

骨長(zhǎng)入是指骨組織通過(guò)植入物表面或內(nèi)部的微孔或孔隙結(jié)構(gòu)與植入物完成骨性結(jié)合。影響多孔植入物骨長(zhǎng)入的因素很多，如孔隙率、孔徑、孔隙連通性、材料的生物相容性、生物活性、應(yīng)力刺激等[11]。關(guān)于適合骨長(zhǎng)入的最佳孔隙率，一般認(rèn)為高孔隙率不影響細(xì)胞黏附，可提供利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧流動(dòng)、運(yùn)輸?shù)目臻g，促進(jìn)細(xì)胞增殖和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成血管化，有利于骨長(zhǎng)入；孔隙率過(guò)小則導(dǎo)致孔隙空間狹窄，缺少有效聯(lián)通，細(xì)胞增殖到一定范圍會(huì)產(chǎn)生“接觸抑制”[12]。CHENG等[13]在制作的15%、38%、70%孔隙率多孔鈦支架上培養(yǎng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)高孔隙率較低孔隙率更利于細(xì)胞分化。王雷等[14]將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入40%和70%孔隙率的多孔鈦合金支架中，培養(yǎng)72 h后發(fā)現(xiàn)70%孔隙率較40%孔隙率更適宜細(xì)胞的黏附和增殖。有學(xué)者[15]通過(guò)觀察翻修的生物型多孔假體，發(fā)現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)里新生骨占比不到10%，并且孔隙內(nèi)骨質(zhì)交聯(lián)較少，考慮這種現(xiàn)象可能與假體的孔隙率過(guò)低有關(guān)。

但并不是孔隙率越高越有利于骨長(zhǎng)入。LV等[16]通過(guò)向多孔金屬假體中植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)73%孔隙率組的細(xì)胞活性和分化情況均優(yōu)于81%孔隙率組。周鵬等[17]分別將3種孔徑和孔隙率均不相同的3D打印鈦合金假體植入兔股骨髓腔，結(jié)果表明，262 μm孔徑、68.1%孔隙率的假體在骨體積分?jǐn)?shù)、組織礦物密度和最大拔出力等方面均高于558 μm孔徑、79.2%孔隙率和753 μm孔徑、89.0%孔隙率假體。另外，也有少數(shù)文獻(xiàn)稱中、高孔隙率對(duì)骨長(zhǎng)入的影響無(wú)顯著差異，如KUJALA等[18]構(gòu)建鼠股骨缺損模型并植入47%和66%孔隙率的鎳鈦合金支架，結(jié)果顯示2組孔隙率對(duì)成骨的影響并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，75%孔隙率的鈦板孔隙中新骨形成率達(dá)到36.96%，明顯高于其他2組的新骨形成率。分析其原因可能是75%孔隙率比例合適，孔隙間連通性高，為成骨細(xì)胞提供足夠生長(zhǎng)空間，更易于氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸；多孔鈦板為貼附融合，孔隙結(jié)構(gòu)厚度有限，35%孔隙率過(guò)于緊密，孔隙間無(wú)法形成有效交通，導(dǎo)致新骨組織局限在外圍，無(wú)法深入其中。

目前，對(duì)于像本實(shí)驗(yàn)這種以多孔植入物在顱頸表面、長(zhǎng)骨骨皮質(zhì)骨表面直接貼合形式的骨長(zhǎng)入研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究具有一定的創(chuàng)新性，可以為此類骨長(zhǎng)入研究提供參考。但本實(shí)驗(yàn)也存在一些局限和不足之處：(1)相關(guān)研究不多，缺乏大量相關(guān)文獻(xiàn)的支持，結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有限也缺乏統(tǒng)一；(2)樣本量不多，長(zhǎng)入時(shí)間有限，未能觀察更長(zhǎng)時(shí)間骨長(zhǎng)入情況。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還需要針對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行完善。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)3D打印多孔鈦板的孔隙結(jié)構(gòu)，可以允許新生骨長(zhǎng)入；不同孔隙率大小，影響3D打印鈦金屬植入物的新生骨長(zhǎng)入效果；35%、55%、75%三種孔隙率中，75%孔隙率較其他兩組較低孔隙率更有利于骨長(zhǎng)入；75%孔隙率3D打印多孔鈦板可與經(jīng)適當(dāng)處理的皮質(zhì)骨表面實(shí)現(xiàn)良好的骨性融合。實(shí)驗(yàn)具有一定的科學(xué)性和創(chuàng)新性，可為3D打印個(gè)體化定制枕頸融合器在骨性融合方面提供參考。