人乳頭瘤病毒的感染現(xiàn)況及免疫治療研究進(jìn)展

李甜甜 武麗 呂霄 夏建紅

廣東省婦幼保健院（廣州511400）

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是STAUSS在1949年通過電鏡發(fā)現(xiàn)的。它是一種雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，普遍存在人與動物，因只感染人而具有高度特異性。根據(jù)病毒基因組DNA序列的不同，可以將HPV分成不同型別。目前有超過400多型別的HPV被發(fā)現(xiàn)，這些病毒感染人體后主要是在皮膚及黏膜的上皮結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，進(jìn)而導(dǎo)致更廣范圍的病變。有超過300多種的HPV被臨床醫(yī)生及科研學(xué)者所研究，從這些研究來看，人群感染HPV是非常普遍的。隨著研究的深入，HPV與疾病的關(guān)系也越來越被關(guān)注。感染不同類型的HPV病毒所導(dǎo)致的結(jié)局不同，長期感染高危型HPV容易發(fā)生黏膜和皮膚的鱗狀細(xì)胞癌，長期感染低危型HPV病毒可以導(dǎo)致良性病變，但低危型的HPV感染也可導(dǎo)致惡性腫瘤［1］。

目前國內(nèi)外大多數(shù)研究是從疾病致病性的角度分析，得出致病人群中HPV的感染情況及HPV的分型情況。但很少有大型的流行病學(xué)調(diào)查是針對人群中HPV自然感染情況進(jìn)行相關(guān)方面的研究。隨著預(yù)防性的疫苗上市，了解我國女性人群中HPV自然感染情況及HPV分型情況，不僅可以對由HPV引起的疾病進(jìn)行針對性的一級預(yù)防，還可以指導(dǎo)臨床制定適合我國女性的HPV篩查方案及制定適合我國女性的預(yù)防性HPV疫苗接種方案。而對于已經(jīng)感染HPV的女性，HPV病毒的治療仍存在較大的爭議。HPV病毒感染人體后將終身攜帶，目前治療上選擇性的去除病毒是否合乎需要仍不明確，因?yàn)榇蟛糠諬PV病毒是人重要的組成部分，但是也有學(xué)者研究后提出人感染HPV病毒需要積極的干預(yù)處理，并且清除HPV病毒可以阻止疾病的發(fā)生、發(fā)展［2］。目前國內(nèi)外針對HPV病毒感染的治療方法有：冰凍療法、三氯乙酸、激光、抗病毒藥物或者手術(shù)的方法切除，但治療后仍有部分患者會存在治療失敗或者重新感染新的HPV病毒的可能［3］。可見這些治療方法對病毒清除的作用是有限的。為了能更好地清除HPV病毒，治療性的疫苗成為了國內(nèi)外新的研究熱點(diǎn)。但疫苗的種類、佐劑的使用等問題仍處于研究階段。針對以上方面的內(nèi)容，文本將對我國女性HPV自然感染情況及國內(nèi)外HPV病毒免疫治療進(jìn)展進(jìn)行綜述，為臨床提供相應(yīng)的指導(dǎo)。

1 HPV感染現(xiàn)況

HPV相關(guān)的宮頸癌是最常見的癌癥之一，被列為中國女性第八大常見殺手，而且HPV感染開始有年輕化的趨勢。從疾病的角度分析，ZHOU等［4］通過系統(tǒng)評價(jià)的方法，對303篇文章進(jìn)行了評價(jià)，他們評估了宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者，發(fā)現(xiàn)最常見感染的HPV有 HPV16、18、58、52、33、31、55、68、53及45型，且HPV感染的發(fā)病率在20～24歲之間達(dá)到高峰，此后大幅度下降并穩(wěn)定在中年；與生活在發(fā)達(dá)省份的女性相比，在欠發(fā)達(dá)地區(qū)45～55歲的女性中發(fā)現(xiàn)第二高峰。

針對健康女性人群中HPV的感染情況，ZHANG等［5］對我國沿海發(fā)達(dá)地區(qū)的健康人進(jìn)行宮頸HPV病毒的篩查，他們共募集了2 717名參與者，其中432名（15.9%）參與者呈現(xiàn)HPV陽性；以HPV52、16、53、51及58型最為常見。WANG等［6］收集了華中、華東地區(qū)（武漢、杭州、湖州、嘉興、寧海、臺州、舟山、諸暨）11家大型醫(yī)院的480 034份宮頸標(biāo)本，其中HPV感染率為17.8%（73 713/414 540），以HPV16、31、33、35、52及58型最為常見。TANG等［7］對我國西南地區(qū)（重慶地區(qū)）女性HPV感染情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，他們收集了40 311例體檢女性的宮頸標(biāo)本，其中感染HPV的有26.2%，HPV16、52、58型為重要的型別，但HPV16、18型的患病率相比國際薈萃分析報(bào)道的平均值要低。JIANG等［8］在山東收集了94 489例體檢女性宮頸標(biāo)本，其中HPV感染率為28.4%（26 839/94 489），以HPV 16、52、58和56型最為常見。根據(jù)不同經(jīng)濟(jì)水平調(diào)查HPV感染情況，ZHAO等［9］則對我國經(jīng)濟(jì)相對落后的農(nóng)村人群（山西）進(jìn)行了HPV病毒的感染情況調(diào)查，他們納入了1 274名婦女，只針對高危型的HPV進(jìn)行了篩查，其中15%的女性高危型HPV病毒陽性，以HPV16、52型最為常見。

綜上可以看出我國女性的HPV自然感染率偏高，且不同地域、不同經(jīng)濟(jì)水平其HPV自然感染情況具有一定差異性。從HPV自然感染的型別來看，HPV16型和52型是主要的感染型別，其次是HPV58型和18型在自然感染中并不是常見的型別。

2 HPV的清除機(jī)制

大部分女性可以通過宿主的免疫反應(yīng)自發(fā)的清除HPV病毒。BAUSSANO等［10］通過建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型，并在多地進(jìn)行臨床驗(yàn)證，得出HPV的自然清除率約為90%。機(jī)體感染HPV病毒后，會引起體液免疫和細(xì)胞免疫。對于HPV而言，首先要通過受損的皮膚或者上皮對機(jī)體進(jìn)行感染，當(dāng)損傷到上皮的基底層時(shí)，HPV病毒開始增殖分裂，而損傷的組織則可以引起體液和細(xì)胞免疫。

2.1體液免疫HPV感染機(jī)體之后，體內(nèi)的非特異性的免疫細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）將做出應(yīng)答，它們會分泌如白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-12（IL-12）、白介素-1β（IL-1β）和干擾素等炎癥因子激活自然殺死（natural killer，NK）細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞［11］。在此過程中，淋巴B細(xì)胞通過識別不同類型HPV病毒中的L1、E2和E4而產(chǎn)生不同類型的抗體；當(dāng)HPV病毒的DNA整合到細(xì)胞的基因后，還可以檢測到針對E6、E7的抗體蛋白。但是產(chǎn)生的這些抗體蛋白的效能都非常弱而且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，不足以抵抗HPV病毒的再次感染［12］。但是抗體滴度可以持續(xù)多年甚至是HPV病毒已經(jīng)清除之后。可以看出機(jī)體的體液免疫并不能消除HPV病毒。

圖1 HPV感染后引起的細(xì)胞免疫過程Fig.1 Cellular immune process caused by HPV infection

2.2細(xì)胞免疫在病毒的清除方面，細(xì)胞免疫起到非常大的作用。樹突細(xì)胞能從感染的上皮細(xì)胞中提取HPV病毒，并攜帶進(jìn)入淋巴結(jié)中；在樹突細(xì)胞中，通過MHCⅠ類和MHCⅡ類分子對抗原進(jìn)一步標(biāo)記，進(jìn)而分別遞呈給CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，接受刺激的CD8+T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒T細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)型T細(xì)胞抑制細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性，分化成熟的細(xì)胞毒T細(xì)胞可以清除在細(xì)胞內(nèi)的HPV病毒，具體過程見圖1［13］。從機(jī)體的應(yīng)答反應(yīng)來看，任何一種運(yùn)用免疫方法治療HPV病毒的方法，都是要盡可能的誘導(dǎo)強(qiáng)大的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)以及CD4+T細(xì)胞反應(yīng)以確保其方法的有效性。

3 HPV的致病機(jī)制

事實(shí)上，只有一小部分HPV感染的個(gè)體最終會發(fā)生癌變，這不僅與HPV病毒感染時(shí)間、種類有關(guān)，還與其他因素如遺傳易感性、生活習(xí)慣及免疫反應(yīng)的改變等因素有關(guān)［14］。已經(jīng)在HPV導(dǎo)致的相關(guān)腫瘤中發(fā)現(xiàn)，HPV病毒之所以能導(dǎo)致疾病，是因?yàn)楦腥救梭w之后，被機(jī)體識別到的HPV病毒可以通過體液和細(xì)胞免疫清除，然而感染機(jī)體后的HPV病毒可以在上皮細(xì)胞內(nèi)合成顆粒分子，使得HPV整個(gè)生命周期都處于不能被細(xì)胞溶解酶溶解的狀態(tài)，從而減少機(jī)體的免疫應(yīng)答［15］。HPV病毒感染機(jī)體后還擅長將自身的基因整合到宿主的基因中，整合后合成如L1、E7蛋白，從而使得L1、E7蛋白既能表達(dá)又能逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測［16-17］。正是因?yàn)榘l(fā)生了一系列的免疫逃逸，使得低水平的感染因子可以與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫共存，進(jìn)而導(dǎo)致疾病。HPV病毒的免疫逃逸機(jī)制十分復(fù)雜，它涉及蛋白的轉(zhuǎn)錄、抗原遞呈的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)、黏附分子的調(diào)節(jié)以及信號通路方面的調(diào)節(jié)等等方面［15］。綜上所述，HPV感染機(jī)體后會盡可能使得自己“低調(diào)”而逃避免疫應(yīng)答。目前各種治療HPV的方法，則是希望通過各種方法加強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療的目的。

4 清除病毒的干預(yù)方法

4.1抗病毒治療干擾素是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)劑功能的藥物，干擾素可以與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，從而抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。RAKHMATULINA等［18］發(fā)現(xiàn)干擾素可以預(yù)防和消除HPV病毒感染，且他們推測干擾素是通過減輕最初的免疫紊亂，提高治療效果。SHI等［19］通過對比高低劑量的干擾素聯(lián)合紅光治療宮頸陰道的HPV感染，他們得出高劑量的干擾素聯(lián)合紅光治療HPV感染是有效且安全的。其他類型的抗病毒藥物也有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)方面的研究，其中JACKOWSKA等［20］針對由HPV6、11型引起的復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤病運(yùn)用貝伐單抗和西多福韋輔助治療，發(fā)現(xiàn)這兩種藥物可以改善治療效果，減少手術(shù)次數(shù)。NIKAKHTAR等［21］則發(fā)現(xiàn)桃金娘的草藥栓劑可以抗病毒、抗誘變和促凋亡的作用，他們運(yùn)用于宮頸陰道HPV感染的患者，通過雙盲隨機(jī)試驗(yàn)，他們得出這種栓劑可以加速病毒清除。

4.2治療性HPV疫苗治療性的HPV疫苗意在加強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的作用而發(fā)揮治療作用。在治療性疫苗抗原的選擇方面，由于HPV病毒DNA中的E6、E7基因是致癌基因，且其編碼的蛋白是導(dǎo)致癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，并且在正常組織中E6、E7蛋白不表達(dá)，因此E6、E7常被選為治療性疫苗的抗原。也有學(xué)者為了擴(kuò)大疫苗的治療范圍，選擇HPV基因中的保守E1和E2蛋白系列作為疫苗的抗原［22］。由于疫苗都存在不同程度的轉(zhuǎn)染效率低的問題，研究者則摸索了多種類型的疫苗以提高轉(zhuǎn)染率和免疫原性，如活載體類疫苗、蛋白多肽類疫苗、DNA疫苗以及加強(qiáng)樹突狀細(xì)胞作用的疫苗。

4.2.1活載體類疫苗在活載體類疫苗方面，YANG等［23］使用牛乳頭狀瘤病毒（BPV）作為載體，制備了pcDNA3-BPVL1-E7（49-57）治療性疫苗，并讓其轉(zhuǎn)染293-Db細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它可以有效的激活針對E7特異性的CD8+T細(xì)胞，同時(shí)他們得出電穿孔轉(zhuǎn)染比肌肉注射的轉(zhuǎn)染率要高。?UBURU等［24］使用腺病毒作為疫苗的載體，發(fā)現(xiàn)這種疫苗不僅能刺激IFN-γ和TNF-α的分泌，還能誘導(dǎo)HPV特異性CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答。類似的KHAN等［25］也使用腺病毒作為載體，但是為了適用HPV病毒感染后疾病每個(gè)階段，他們選擇了由E2，E6和E7融合蛋白序列組成的HPV16和HPV18特異性抗原，在小鼠模型中他們發(fā)現(xiàn)該治療性疫苗可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫原性。MILES等［26］則選擇了單核細(xì)胞增生李斯特細(xì)菌（Lm）作為載體，融合成Lm-LLOHPV E7新型免疫治療疫苗，并發(fā)現(xiàn)該疫苗在宮頸癌、肛門癌等臨床試驗(yàn)中有效。JIA等［27］則使用減毒的Lm搭載表達(dá)HPV-E7的疫苗，并接種在小鼠的腹腔，發(fā)現(xiàn)該疫苗可以降低腫瘤大小，甚至還可以使得腫瘤完全消退。WANG等［28］使用畢赤酵母菌作為載體，并且糖基化HPV16-E7序列，相比沒有糖基化的疫苗，該疫苗可以增加樹突細(xì)胞對該疫苗的攝取，進(jìn)而增加IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌，脾臟也會針對E7分泌更多CD8+T細(xì)胞。GTL001是一種以百日咳博得特氏菌為載體的二價(jià)治療性疫苗，它的抗原主要是HPV16和HPV18型的E7蛋白系列。ESQUERRE等［29］使用這種二價(jià)治療疫苗，發(fā)現(xiàn)它可以通過免疫反應(yīng)誘導(dǎo)殺死表達(dá)HPV E7的細(xì)胞。

4.2.2蛋白多肽類疫苗有關(guān)蛋白多肽類疫苗，WANG等［30］制備出HPV16 E7肽和假絲酵母的多肽類疫苗，發(fā)現(xiàn)多肽類治療性疫苗可以誘導(dǎo)特異性的CD8+T細(xì)胞的及Th1 CD4+T細(xì)胞的應(yīng)答。VARYPATAKI等［31］也使用合成的多肽作為疫苗去治療由HPV誘導(dǎo)的腫瘤。進(jìn)一步研究，GRANADILLO等［32］在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者身上使用LALF32-51治療性蛋白疫苗，發(fā)現(xiàn)蛋白類疫苗對控制由HPV病毒引起的轉(zhuǎn)移性腫瘤有控制的作用。

4.2.3DNA疫苗SOLEIMANJAHI等［33］使用優(yōu)化型E7的DNA序列和野生型E7 DNA序列進(jìn)行融合，并用這種融合DNA疫苗治療小鼠，收集小鼠的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)融合DNA疫苗能引起不同水平的IFN-γ和CTLs的應(yīng)答，增強(qiáng)了HPV腫瘤模型中特異性細(xì)胞應(yīng)答。AHN等［34］則使用既能編碼HPV E6、E7又能編碼鈣網(wǎng)蛋白的DNA疫苗，使用電穿孔的方式進(jìn)行接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種DNA疫苗可以顯著增加特異性CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，并能抑制腫瘤的生長速率。

5 免疫佐劑的使用

為了加強(qiáng)治療性疫苗的免疫應(yīng)答，很多研究者會配合使用佐劑。TALEBI等［35］使用HMGB1和Hp91蛋白作為刺激免疫的佐劑。VARYPATAKI等［31］則使用攜帶陽離子的脂質(zhì)體作為免疫佐劑。PENNISI等［36］選擇柑橘的衍生物作為免疫佐劑加強(qiáng)免疫應(yīng)答。SALES等［37］發(fā)現(xiàn)電穿孔能促進(jìn)抗原遞呈和局部遷移，并且能增加CD8+T細(xì)胞的浸潤。DE ROSA等［38］使用紫雛菊提取物作為免疫調(diào)節(jié)劑運(yùn)用于生殖器尖銳濕疣的患者身上，發(fā)現(xiàn)這種免疫調(diào)節(jié)劑可以降低HPV感染的復(fù)發(fā)。

6 其他免疫治療

HPV的免疫治療除了通過治療性疫苗增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的免疫活性外，還可以增加其他免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞的功能而加強(qiáng)免疫應(yīng)答。LI等［39］發(fā)現(xiàn)λ-角叉菜膠能改善樹突狀細(xì)胞的功能，降低樹突狀細(xì)胞的內(nèi)吞作用，促進(jìn)其成熟并通過TLR-4介導(dǎo)的信號通路增強(qiáng)細(xì)胞因子的作用。T細(xì)胞治療也開始受到研究者的關(guān)注。MCCORMACK等［40］通過體外生產(chǎn)出針對HPV特異性的T細(xì)胞，并將其用于HPV相關(guān)的疾病中，得出這種T細(xì)胞產(chǎn)品可以作為HPV相關(guān)疾病的強(qiáng)效補(bǔ)救療法。

綜上可以看出目前國內(nèi)外并沒有一種十分完美的病毒清除治療方案。根據(jù)目前的研究現(xiàn)況，無論是活載體類疫苗、蛋白多肽類疫苗、DNA疫苗以及加強(qiáng)樹突狀細(xì)胞作用的疫苗，都存在轉(zhuǎn)染率低和疫苗免疫原性不強(qiáng)的問題。當(dāng)使用免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫原性時(shí)，應(yīng)注意佐劑使用的安全性問題。因此如何增強(qiáng)疫苗轉(zhuǎn)染性并盡可能使被HPV感染的細(xì)胞暴露于免疫系統(tǒng)中成為目前HPV免疫治療亟待解決的問題。

7 展望及趨勢

從疾病的病因角度分析HPV的感染情況，可知HPV16、18型為常見的致病類型。但是從我國健康人群HPV病毒的篩查結(jié)果來看，高危型HPV病毒中HPV18型并不是常見類型，最為常見的類型為HPV 16型和52型，其次是HPV 58型為常見類型。從臨床指導(dǎo)的角度來看，宮頸的液基細(xì)胞學(xué)檢測聯(lián)合HPV16、18、52、58型檢測是我國宮頸癌篩查可接受的策略。而在預(yù)防型疫苗的選擇方面，我國女性應(yīng)該盡可能選擇包含這4類HPV分型的疫苗。從數(shù)據(jù)分析可知，不同地區(qū)、不同經(jīng)濟(jì)情況的人群HPV自然感染率具有一定的差異，是由于何種因素導(dǎo)致的差異性值得進(jìn)一步的深入研究。

在干預(yù)治療方面，近年來HPV的免疫治療成為新的熱點(diǎn)?？偟膩碚f，免疫治療有望成為已經(jīng)感染HPV病毒患者清除HPV病毒的方法，但是在研究的過程中仍有許多問題需要解決。如疫苗抗原的選擇、疫苗劑型的選擇、治療的范圍以及佐劑的選擇都處于探索階段，且這些試驗(yàn)都是在體外或者動物模型中得到驗(yàn)證，并沒有非常確切的療效。同時(shí)治療性疫苗和佐劑使用的安全性問題也值得進(jìn)一步的研究。