實(shí)時熒光定量PCR法對肝衰竭合并侵襲性肺曲霉菌病患者的診斷價值

卓麗 蘭蕓 李粵平 陳萬山 鄧西龍

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八人民醫(yī)院感染病中心（廣州510060）

侵襲性肺曲霉菌?。╥nvasive pulmonary asper- gillosis，IPA）不僅局限于急性白血病、骨髓干細(xì)胞移植、實(shí)體器官移植、惡性腫瘤化療等傳統(tǒng)的免疫低下患者，也常見于肝衰竭的患者［1］。肝衰竭患者感染IPA后臨床癥狀常不典型，常加重肝衰竭的病情和明顯增加病死率。早期診斷是成功治療IPA的關(guān)鍵，肝衰竭合并IPA患者影像學(xué)方法極少見到“暈輪征、新月征”等曲霉感染的特異性表現(xiàn)［2］。另外，由于肝衰竭患者凝血功能低下，纖維支氣管鏡檢查、肺穿刺或活檢存在容易引起肺出血等危及生命的高風(fēng)險并發(fā)癥。因此，在臨床上肝衰竭患者難以獲得無菌標(biāo)本培養(yǎng)及病理組織學(xué)標(biāo)本以確診IPA。根據(jù)文獻(xiàn)［3-4］報道，實(shí)時熒光定量PCR法測定血清曲霉菌DNA含量的敏感性及特異性均較半乳甘露聚糖檢測（GM試驗(yàn)）高，可以協(xié)助診斷IPA。本研究擬通過熒光實(shí)時定量PCR法檢測肝衰竭合并IPA患者血清曲霉菌DNA含量，并與GM試驗(yàn)對比，探討該方法在肝衰竭合并IPA診斷的價值。

1 對象與方法

1.1研究對象本研究納入廣州市第八人民醫(yī)院2013年3月至2017年3月住院的肝衰竭患者30例，其中符合診斷肝衰竭合并IPA患者共17例；肝衰竭無肺部感染者13例，并納入20例健康人作為空白對照。肝衰竭患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2018年中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會肝衰竭與人工肝學(xué)組修訂的肝衰竭診療指南中診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，IPA的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南［6］。本研究的一般資料見表1，其中肝衰竭合并IPA與肝衰竭無肺部感染者一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者留血清樣本，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，所有留取血清樣本的患者均簽署知情同意書?/p>

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株及DNA標(biāo)準(zhǔn)品煙曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供，標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于土豆培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3 d，挑取菌落制成曲霉菌屬孢子懸液。血球計數(shù)板顯微鏡下計數(shù)，作為標(biāo)準(zhǔn)菌株存儲液于-20℃冰箱中備用。使用QIAGEN公司真菌DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Mini Kit）提取真菌基因組，提取產(chǎn)物以紫外分光光度計測量A260/280，-80℃保存。菌株DNA通過測序獲得核苷酸序列，經(jīng)BLAST比對驗(yàn)證為曲霉菌DNA。

1.3引物及探針本研究使用既往文獻(xiàn)報道的引物和探針［7］，其靶向5種曲霉菌（煙曲霉菌、黃曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌、米曲霉菌）18s rRNA保守序列的基因，具體序列如下：上游引物5′-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3′，下 游 引 物 5′-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3′，TaqMan探針：5′-FAM-TCGGCCCTTAAATAGCCCG2GTCCGC-TAMRA-3′。

1.4標(biāo)準(zhǔn)品制備以已提取的煙曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA作為模板，使用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接至質(zhì)粒載體（pMD 19-T Vector，TaKaRa，大連），導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，大連）進(jìn)行目的片段的質(zhì)?？寺?，并對菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，Nanodrop 2000核酸定量儀進(jìn)行定量，根據(jù)濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)的公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，拷貝數(shù)濃度（拷貝/mL）=（質(zhì)量/分子量）×6.02×1023。

1.5血清曲霉DNA提取使用200 μL血清進(jìn)行核酸提取，使用QIAGEN公司真菌DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Mini Kit）提取真菌基因組，具體步驟按試劑盒操作進(jìn)行，-80℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測。

1.6實(shí)時熒光PCR檢測血清樣本曲霉DNA實(shí)時熒光PCR反應(yīng)管中依次加入上下游引物各2 μL，TaqMan探針1 μL、2×TaqMan universal PCR master mix（ABI公司，美國）12.5 μL，提取的DNA 模板5 μL，反應(yīng)總體系為25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃2 min，94 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共50個循環(huán)。PCR反應(yīng)在ABI 7300平臺進(jìn)行。

1.7GM試驗(yàn)GM試驗(yàn)采用Platelia Aspergillus（Bio-Rad公司）試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行操作并判讀結(jié)果，由我院檢驗(yàn)科完成。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法本研究計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 30例肝衰竭患者及20例健康肝衰竭無肺部感染組的一般資料Tab.1 The clinical characteristics in 30 cases of liver failure patients and 20 cases of healthy control group

2 結(jié)果

2.1血清GM試驗(yàn)結(jié)果本研究納入的30例肝衰竭的患者中，GM試驗(yàn)陽性者共12例，肝衰竭合并IPA組9例，陽性率為52.94%（9/17）；肝衰竭無肺部感染組3例，陽性率為23.08%（3/13）。GM試驗(yàn)陰性者共18例，肝衰竭合并IPA組8例，肝衰竭無肺部感染組10例。20例健康肝衰竭無肺部感染組的血清GM試驗(yàn)均為陰性。

2.2熒光定量PCR法血清標(biāo)本曲霉菌DNA檢測結(jié)果根據(jù)質(zhì)粒的熒光PCR定量結(jié)果，本研究實(shí)時熒光定量的靈敏度為100 copies/mL，在實(shí)時熒光定量PCR法測定30份血清標(biāo)本中，有16份可檢測出曲霉菌DNA，最大值為7 988.73 copies/mL，最小值為281.11 copies/mL，中位數(shù)為938.79 copies/mL?？蓹z測到曲霉菌DNA的樣本均視為熒光定量PCR陽性，肝衰竭合并IPA組15例，肝衰合并IPA組為88.2%（15/17）；肝衰竭無肺部感染組12例，陽性率為7.7%（1/13）。曲霉DNA定量≥1 000 copies/mL定義為強(qiáng)陽性，肝衰合并IPA組為6例，強(qiáng)陽性率為35.29%（6/17），肝衰竭無肺部感染組無檢測出強(qiáng)陽性的曲霉DNA。20例健康肝衰竭無肺部感染組血清曲霉DNA檢測均為陰性。

2.3肝衰竭合并IPA組與肝衰竭無肺部感染組兩種檢測結(jié)果的比較

2.3.1肝衰竭合并IPA組血清曲霉菌DNA與GM試驗(yàn)結(jié)果的比較在肝衰竭合并IPA組17例的血清樣本中，實(shí)時熒光定量PCR測定血清曲霉菌DNA陽性15例（88.2%），陰性2例（11.8%）；GM試驗(yàn)陽性9例（47.1%），陰性8例（52.9%）。兩種方法陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.026），實(shí)時熒光定量PCR測定曲霉DNA陽性率明顯高于GM試驗(yàn)。肝衰竭合并IPA組中，熒光定量PCR法測定血清曲霉菌DNA強(qiáng)陽性的患者共6例（35.3%），熒光定量PCR法測定血清曲霉菌DNA強(qiáng)陽性率與GM試驗(yàn)陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.728）。見表2。

表2 肝衰竭合并IPA組兩種試驗(yàn)方法陽性率的比較Tab.2 Comparison of the difference of positive rate between real-time PCR and GM test method in the liver failure patients with IPA 例（%）

2.3.2肝衰竭無肺部感染組血清曲霉菌DNA與GM試驗(yàn)結(jié)果的比較在肝衰竭無肺部感染組的13例血清樣本中，熒光定量PCR測定血清曲霉菌DNA陽性1例（7.7%），陰性12例（92.3%）；GM試驗(yàn)陽性3例（23.1%），陰性10例（77.0%）。兩種方法陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.592），見表3。

表3 肝衰竭無肺部感染組兩種試驗(yàn)方法陽性率的比較Tab.3 Comparison of the difference of positive rate between real-time PCR and GM test method in the liver failure patients without pulmonary infection 例（%）

3 討論

肝衰竭患者由于使用廣譜抗生素或激素治療，容易合并淺部或深部真菌感染，合并IPA的臨床表現(xiàn)較為隱匿且預(yù)后差，死亡率高［8-10］。肝衰竭并發(fā)IPA的高死亡率不僅與基礎(chǔ)疾病的嚴(yán)重性有關(guān)，還與未能及時明確診斷有關(guān)。意大利學(xué)者報道了他們經(jīng)治的2例重癥肝病并IPA以及總結(jié)的文獻(xiàn)報道的72例重癥肝病并發(fā)IPA的患者，病死率高達(dá)72.2%，僅35例患者接受了抗真菌治療，其余患者均為死亡后才得以確診［11］。國內(nèi)的學(xué)者也對肝衰竭合并IPA進(jìn)行研究，研究結(jié)果提示早期診斷是成功治療的關(guān)鍵［12］。

肝衰竭的患者合并IPA臨床表現(xiàn)常隱匿，早期的肺部CT的表現(xiàn)不典型，早期診斷較為困難，GM試驗(yàn)為臨床常用的輔助診斷的指標(biāo)，但由于其存在假陽性和假陰性，尤其是血清樣本［13-15］，可能延遲初始抗真菌治療的時間，影響臨床的療效。熒光定量PCR檢測曲霉菌DNA較高的靈敏度和特異性，既往曾有國內(nèi)外學(xué)者使用熒光定量PCR對IPA的診斷進(jìn)行研究。德國學(xué)者應(yīng)用熒光實(shí)時定量PCR方法檢測曲霉菌DNA，認(rèn)為其敏感性高，同時能準(zhǔn)確定量、假陽性率低，有利于侵襲性曲霉菌的早期診斷［16］。以色列學(xué)者回顧性分析2005-2016年使用熒光實(shí)時定量PCR方法檢測肺泡灌洗液曲霉菌DNA的結(jié)果，也認(rèn)為使用熒光實(shí)時定量PCR方法檢測曲霉菌DNA有高靈敏性和特異性的特點(diǎn)［17］。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用熒光定量PCR檢測接受異基因造血干細(xì)胞移植患者56例的血清曲霉菌DNA進(jìn)行研究，結(jié)果提示敏感度和特異度分別為94.4%和100.0%［2］。提示熒光定量PCR檢測血清曲霉菌DNA有利于早期診斷IPA。但目前，熒光定量PCR檢測在肝衰竭合并侵襲性肺曲霉菌病患者的診斷價值的報道較少。

本研究的結(jié)果表明，在17例診斷IPA患者中，16例熒光定量PCR檢測血清曲霉菌DNA陽性，靈敏度優(yōu)于GM試驗(yàn)；肝衰竭無肺部感染組的13例患者僅有1例患者的血清樣本陽性，GM試驗(yàn)3例陽性，雖熒光定量PCR法與GM試驗(yàn)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但陽性率低于GM試驗(yàn)。綜上所述，熒光定量PCR檢測外周血曲霉DNA可協(xié)助肝衰竭合并侵襲性肺曲霉菌病的診斷，但I(xiàn)PA早期臨床表現(xiàn)無特異性，本研究暫未納入早期IPA患者的血清樣本進(jìn)行研究，因此，下一步的研究擬納入肝衰竭并早期IPA患者的血清樣本進(jìn)行研究，探討熒光定量PCR檢測外周血曲霉DNA對肝衰竭合并IPA早期診斷的應(yīng)用價值，另外，本研究的樣本量較少，亦需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。