茵陳蒿湯對非酒精性脂肪肝伴糖尿病大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶表達的影響

周偉青 劉道利 王修銀 江桂英 李秋明 林佳

廣州市中醫(yī)醫(yī)院1檢驗科，2病理科，3藥學部（廣州510130）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積導致的疾病，同時排除酒精因素和其他肝損害因素。NAFLD根據(jù)病情嚴重程度，可分為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化等。近年來，隨著人民群眾生活水平的提高，肥胖人群比例逐年上升，NAFLD的發(fā)病率也顯著升高［1］。對于NAFLD的治療，主要以調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、降血脂、胰島素增敏劑、改善肝功能等為主。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者多合并有胰島素抵抗，甚至糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）。既往的研究指出，茵陳蒿湯能夠通過調(diào)節(jié)p38MAPK控制NAFLD的疾病進展，但其對NAFLD合并DM的療效研究較少［2］。本次研究通過建立NAFLD合并DM的大鼠模型，研究p38MAPK在大鼠肝臟中的表達，并探討茵陳蒿湯對其的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物150～180 g，SPF級，5～7周齡SD大鼠，雌雄各半［購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證SCXK（粵）2013-0002］；在溫度25℃、相對濕度50%的獨立通氣籠里進行無菌飼養(yǎng)，且符合清潔級實驗動物的飼養(yǎng)標準。小鼠均進行編號，編號標簽貼于飼養(yǎng)籠處，并按隨機數(shù)字表法將實驗小鼠分為3組：對照組（12只）、DM組（15只）、DM+藥物組（12只）。

對照組大鼠予以低脂飼養(yǎng)56 d，而DM組和DM+藥物組大鼠均以高脂（膽固醇2%，豬油10%加入基礎(chǔ)飼料中）飼養(yǎng)28 d后，予以空腹一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg），3 d后所有動物禁食12 h，麻醉后經(jīng)大鼠眼眶后靜脈叢取血后，大鼠立即進行止血、消炎和保溫，清醒后仔細觀察其動態(tài)，無異常情況，繼續(xù)飼養(yǎng)。血液標本立即低溫保存，送檢，用日立全自動生化分析儀7180檢測空腹血糖，經(jīng)反復3次實驗測定結(jié)果均空腹血糖＞7.8 mmol/L，成功建立DM大鼠模型。繼續(xù)予以高脂飼養(yǎng)8周，隨機抽取3只DM組大鼠進行形態(tài)學觀察，均符合NAFLD病理學改變則制作DM伴發(fā)NAFLD模型成功。

1.2方法

1.2.1動物模型和用藥高脂飼養(yǎng)8周后，12只DM+藥物組大鼠繼續(xù)予以1 mL/100 g鼠重的茵陳蒿湯［3］（廈門中藥廠）；而12只對照組和剩下12只DM組則予以相應(yīng)量的飲用水灌服；連續(xù)灌服28 d。

1.2.2生化指標測定禁食半天后采用ES-500E電子天平進行體質(zhì)量測量并記錄，單位為g。實驗大鼠麻醉后處死，在實驗小鼠腹主動脈取血2 mL，高速離心，4℃，3 000 r/min離心15 min，用日立全自動生化分析儀7180檢測空腹血糖、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽固醇（total cholesterol，TC）。

1.2.3肝臟病理檢查完整取出實驗大鼠的肝組織，采用ES-500E電子天平對肝組織稱重并記錄，單位為g，計算肝體比（肝體比=肝重/體質(zhì)量）。稱取1 g肝組織，梯度脫水，冰凍切片膠包埋，采用冰凍切片機進行冰凍切片（片厚4.0 μm），HE染色，熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.4Western blot檢測p38MAPK蛋白表達水平取1 g肝組織塊置于預冷的單去污裂解液（含PMSF）于勻漿器中進行勻漿，裂解30 min后，將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液按BSA法測定總蛋白濃度，計算含40 μg蛋白的上層緩沖液，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，室溫平搖2 h，取出PVDF膜，用TBS/T漂洗3次，每次5 min，置于干凈平皿中，分別加入兔抗大鼠p38MAPK抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶1 000），4℃過夜，取出PVDF膜，TBS/T漂洗3次，每次5 min，再分別加入山羊抗兔IgG（1∶3 000），室溫孵育1 h，取出PVDF膜，用TBS/T漂洗3次，每次5 min，除去未結(jié)合的二抗進行顯色反應(yīng)，分析條帶的吸光度。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用s表示，多組間采用單因素ANOVA進行檢驗，若方差齊性，兩兩組間采用LSD檢驗進行比較，若方差不齊，則用Tamhane′s T2檢驗進行比較；若P＜ 0.05，則差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1一般情況比較DM組大鼠的體質(zhì)量顯著高于對照組（P＜0.05），而DM+藥物組大鼠的體質(zhì)量則顯著降低（P＜0.05）。DM組大鼠的肝重及肝體比均顯著高于對照組（P＜0.05），而DM+藥物組大鼠的肝重及肝體比均顯著降低（P＜0.05）。DM+藥物組大鼠的空腹血糖水平亦較DM組明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.2肝臟病理檢查結(jié)果分析對照組大鼠肝臟細胞排列整齊，大小正常，無明顯炎性變化或脂肪（圖1）。DM組大鼠肝臟細胞排列紊亂，體積增大伴炎性浸潤，匯管區(qū)胞漿內(nèi)可見脂肪空泡，肝組織內(nèi)可見明顯點灶狀壞死（圖2）。DM+藥物組大鼠肝臟細胞存在脂肪樣變，壞死病灶縮小，脂肪空泡和炎性細胞浸潤減少（圖3）。

表1 3組大鼠體質(zhì)量、肝重及血糖情況比較Tab.1 comparison of body weight，liver weight，and blood glucose of mice in 3 groups 例（%）

2.3生化指標比較DM組大鼠的ALT、AST和TC水平均較對照組顯著升高（P＜0.05）；而與DM組相比，DM+藥物組大鼠ALT、AST和TC水平均顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.4肝臟組織p38MAPK的表達比較Western blot檢測結(jié)果顯示，DM組大鼠肝臟p38MAPK表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），而DM+藥物組的p38MAPK表達水平顯著高于DM組（P＜0.05），見表3和圖4。

圖1 對照組大鼠肝臟病理檢查結(jié)果分析（HE染色，200×） 圖2 DM組大鼠肝臟病理檢查結(jié)果分析（HE染色，200×）圖3 DM+藥物組大鼠肝臟病理檢查結(jié)果分析（HE染色，200×）Fig.1 Pathological examination of the mice liver in blank group（HE Staining，200×） Fig.2 Pathological examination of the mice liver in DM group（HE Staining，200 ×） Fig.3 Pathological examination of the mice liver in DM+Drug group（HE Staining，200×）

表2 3組大鼠生化指標比較Tab.2 Comparison of biochemical biomarkers of mice in 3 groups ± s

表2 3組大鼠生化指標比較Tab.2 Comparison of biochemical biomarkers of mice in 3 groups ± s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與DM組相比，bP＜0.05

組別對照組DM組DM+藥物組ALT（U/L）30.07±1.90 78.73±6.98a 46.63±4.01b AST（U/L）33.31±2.26 52.57±6.30a 38.18±3.61b TC（mmol/L）5.32±0.37 7.32±0.64a 6.33±0.39b

表3 3組大鼠肝臟組織p38MAPK表達情況比較Tab.3 Comparison of p38MAPK expression of the mice liver in 3 groups± s

表3 3組大鼠肝臟組織p38MAPK表達情況比較Tab.3 Comparison of p38MAPK expression of the mice liver in 3 groups± s

注：與對照組相比，aP＜0.05；與DM組相比，bP＜0.05

組別對照組DM組DM+藥物組肝臟組織p38MAPK表達2.86±0.57 0.52±0.07a 1.47±0.36b

3 討論

圖4 3組大鼠肝臟組織p38MAPK表達的結(jié)果（Western blot檢測）Fig.4 p38MAPK expression of the mice liver in 3 groups（Western blot）

近年來，隨著生活水平的提高，社會飲食習慣的改變，肥胖人群逐漸增多，NAFLD的發(fā)病率也逐年升高［4］。NAFLD與患者的體脂率有關(guān)，高血壓、高血糖和高血脂都是該病的危險因素［5］。此外，近年研究顯示NAFLD的發(fā)病與胰島素抵抗存在很大的關(guān)系，p38MAPK信號通路是哺乳動物細胞中介導細胞反應(yīng)的重要信號通路之一，其與細胞增殖、生長、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等都有很大關(guān)系［6-7］。研究［8］表明，p38MAPK是肝臟中葡萄糖代謝和脂肪代謝中極為重要的環(huán)節(jié)，其能夠促進葡萄糖的合并，減少脂肪合成。而在2型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路存在異常，而p38MAPK活性與患者的胰島素抵抗程度存在相關(guān)性［9-10］。既往的研究［11-13］指出，在大鼠NAFLD中的p38MAPK磷酸化明顯增加，而小檗堿、祛痰活血顆粒等藥物都能夠有效調(diào)節(jié)NAFLD模型大鼠的p38MAPK信號通路。茵陳蒿湯記載于《傷寒論》，由茵陳、梔子和大黃構(gòu)成。研究［14］表明，茵陳蒿湯可以促進膽紅素的排泄、保護肝臟細胞膜的完整性、防止氧自由基的生成等功能。既往的研究指出，茵陳蒿湯能夠降低NAFLD患者的血脂情況，在大鼠模型中亦得到了驗證。但茵陳蒿湯對NAFLD合并DM療效的相關(guān)研究較少。

本實驗通過建立DM大鼠模型，并予以茵陳蒿湯治療DM誘導的NAFLD，探討茵陳蒿湯對NAFLD合并DM的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，DM誘導的NAFLD大鼠肝臟中的p38MAPK表達降低，提示p38MAPK通路受到抑制，而茵陳蒿湯能夠提高DM誘導的NAFLD大鼠肝臟p38MAPK表達，提示茵陳蒿湯通過p38MAPK通路減輕NAFLD大鼠肝臟的損傷；而DM大鼠的空腹血糖水平亦有所緩解。本研究為了臨床上應(yīng)用茵陳蒿湯治療NAFLD合并DM患者提供了有力的依據(jù)，亦為深入探討NAFLD合并DM的疾病發(fā)展提供了參考。

既往的研究［15-20］提示，p38MAPK與炎癥反應(yīng)亦有密切的關(guān)系，而NAFLD患者長期處于慢性全身炎癥狀態(tài)，炎癥因子水平較健康人群有明顯升高。因此，在之后的研究中，筆者將著重于進一步探討茵陳蒿湯通過p38MAPK通路調(diào)控通路下游的炎癥因子的機制。

綜上所述，本研究證實了茵陳蒿湯通過調(diào)控p38MAPK，減輕NAFLD合并DM大鼠的肝臟損害和糖代謝異常。筆者將進一步探討其相關(guān)機制，讓茵陳蒿湯能夠用于治療NAFLD合并DM。