microRNA調(diào)控胰腺癌干細胞的作用研究進展

洪樂，肖衛(wèi)東

（南昌大學第一附屬醫(yī)院 普通外科，江西 南昌 330006）

胰腺癌是一種惡性程度高，預后差的消化系惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢，嚴重危害人類健康。國內(nèi)資料顯示，胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第9 位，病死率居第6位[1]。盡管近年來胰腺癌的診治水平有顯著提高，但其預后仍較差，總體5年生存率僅8%左右[2]。這主要歸因于胰腺癌早期診斷困難，進展期手術切除率低、術后易復發(fā)和轉移。最近的研究表明，胰腺癌干細胞（pancreatic cancer stem cells，PCSCs）參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，是引起胰腺癌耐藥、轉移和復發(fā)的主要原因。業(yè)已證實，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨諸多微小RNA（microRNA，miRNA）的異常表達，并參與調(diào)控PCSCs的分化、自我更新等生物學特性[3]。本文就miRNA調(diào)控胰腺癌干細胞的作用研究進展作一綜述。

1 miRNA

miRNA 是一類長度為19-25 個核苷酸的單鏈RNA，通過與靶mRNA 的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）中的“種子序列”結合起到降解mRNA或抑制翻譯的作用，在轉錄后水平調(diào)控基因表達，在多種生物活動中起重要作用[4-5]。自1993年Lee 等[6]首次從秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，至今已經(jīng)識別的miRNA多達38589種（www.mirbase.org）。2002年Calin等[7]提出miR-15a和miR-16在約65%的B細胞慢性淋巴細胞白血病患者中表達下調(diào)，首次揭示了miRNA與腫瘤相關。此后，越來越多的研究證實miRNA在多種腫瘤中異常表達，并且在腫瘤的增殖、分化、侵襲轉移等生物學行為中扮演重要角色。與其它腫瘤一樣，在胰腺癌組織、外周血和胰腺癌細胞系中也存在多種miRNA的表達差異，其中表達上調(diào)的包括miR-221，miR-181a，miR-155，miR-196a，miR-196b等，表達下調(diào)的包括miR-148a，miR-148b，miR-375等，這些異常表達的miRNAs可以作為抑癌基因或癌基因參與胰腺癌的發(fā)病機制[8-9]。

2 PCSCs

2.1 PCSCs 的特征

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中能夠引起腫瘤生長和維持自我更新及分化潛能的一小群細胞，對放療化療均不敏感，其在腫瘤中雖只占很少部分，但確是腫瘤復發(fā)、轉移和耐藥的主要根源[10-11]。2007年Li等[12]第一次報道了在胰腺癌中存在CSCs，其通過流式細胞儀篩選出極少數(shù)CD44+、CD24+、ESA+胰腺癌細胞（約占0.2%～0.8%），進行動物體內(nèi)移植后發(fā)現(xiàn)僅需100個細胞便能形成腫瘤，顯示出極強的成瘤性。此外，PCSCs可以像正常的干細胞一樣，具有自我更新、分化和不對稱分裂的能力，是導致胰腺癌發(fā)生、進展、侵襲、轉移和治療后復發(fā)的一個重要因素[13-14]。然而，關于PCSCs的確切起源仍不清楚。一種理論認為腫瘤干細胞起源于正常干細胞中發(fā)生的累積突變，這些突變最終引發(fā)惡性轉化。另外一些研究表明，分化程度較高的細胞經(jīng)過突變可能會產(chǎn)生不受調(diào)節(jié)的自我更新和干細胞樣特性的能力[15]。

2.2 PCSCs 的表面標記物

CSCs 表面的分子標記物對其分離鑒別尤為重要。在胰腺癌中，雖然C S C s 所占比例較低，但隨著實驗技術的發(fā)展，仍有一些胰腺癌干細胞的表面標志物被發(fā)現(xiàn)。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD44+、CD24+、ESA+胰腺癌細胞具有干細胞樣的高成瘤性、自我更新能力以及多向分化特性，因此認為CD44+、CD24+、ESA+可作為PCSCs的表面標記物。數(shù)月后，Hermann等[16]證實在胰腺癌中存在CD133陽性表達的CSCs，且CXCR4可以作為一部分具有高轉移傾向的CD133+PCSCs的標志。同樣，ALDH也被認為是胰腺癌中的干細胞標志物。在一些異種移植瘤中，具有高ALDH活性的細胞群可有效地啟動腫瘤，且相對于低ALDH活性的CD133+細胞群而言，具有更強的成瘤潛力[17]。

隨著研究的不斷深入，胰腺癌細胞中陰性表達的分子也能成為CSCs表面標志物。Song等[18]研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞中，F(xiàn)oxO1陰性細胞具有干細胞樣的高致瘤性。FoxO1陰性細胞相對于FoxO1陽性細胞生長倍速的增加明顯大于CD133陽性對CD133陰性細胞，或ALDH高對ALDH低表達的細胞，這表明FoxO1作為一種PCSCs標記的特異性比胰腺癌細胞中的CD133與ALDH更好。此外，人們普遍接受的PCSCs的表面標記物還應包括DCLK1、LGR5、CD44v6、c-Met、Tspan8、EpCAM、α6β4、CLD7和CD166等[19-22]。

3 miRNA 調(diào)控PCSCs 的作用

維持正常干細胞自我更新和分化的信號轉導通路發(fā)生異常突變可導致細胞調(diào)控紊亂而過度增殖并形成腫瘤。PCSCs中異常的信號轉導通路參與了胰腺癌的進程，主要包括Notch、Hedgehog、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路。近年來研究表明，胰腺癌中異常表達的miRNA可以通過相應靶基因調(diào)節(jié)以上信號通路（表1），從而促進或抑制PCSCs的分化和自我更新，參與介導胰腺癌的發(fā)生、復發(fā)、轉移和耐藥性[3]。

3.1 miRNA 對PCSCs 的促進作用

Tsukasa等[23]通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)在CD133+胰腺癌細胞株Capan-1M9中敲減CD133基因表達后miR-30 家族的表達水平顯著下降，選取miR-30家族中的miR-30a、-30b和-30c進行相應的細胞功能實驗和EMT相關基因的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-30a、-30b和-30c的高表達促進了CD133+胰腺癌細胞的遷移和侵襲以及間充質(zhì)標志物的升高。此外，根據(jù)靶基因預測軟件TargetScan，預測CD133為miR-30家族的靶基因[23]，CD133+胰腺癌細胞株Capan-1M9中的CD133敲除顯著抑制了腫瘤在體內(nèi)的侵襲和轉移，進一步實驗還發(fā)現(xiàn)CD133是通過與ERK通路的相互作用促進胰腺癌的上皮間質(zhì)轉化[24]。

Hasegawa等[25]在胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)miR-1246呈高表達，腫瘤抑制基因Cyclin G2（CCNG2）呈低表達，且它們負性相關?？紤]到CCNG2參與抑制腫瘤的增殖、侵襲、分化和化療抵抗（這是腫瘤干細胞的特征）以及CCNG2是miR-1246潛在的靶基因，他們通過相應的體內(nèi)和體外實驗證實miR-1246-CCNG2軸對化療耐藥至關重要，miR-1246可能通過靶向CCNG2對胰腺癌干細胞具有促進作用。

胰腺癌細胞群中的一小亞群（SP）細胞具有干細胞樣特性，其能夠在裸鼠體內(nèi)誘導快速和侵襲性的腫瘤形成?；虮磉_譜分析顯示，SP細胞中miR-21和miR-221的表達較其他胰腺癌細胞顯著增高。隨后在胰腺癌細胞中沉默miR-21和miR-221的表達可以抑制胰腺癌的發(fā)生、轉移和化療抵抗，同時顯著降低了SP細胞的數(shù)量[26]。另外，有報道提出PCSCs中Notch-1的過度表達導致體外的miR-21表達增加[27]，miR-21可通過調(diào)節(jié)FoxO1（胰腺癌干細胞標志物）實現(xiàn)對胰腺癌細胞的促進作用[18]。

3.2 miRNA 對PCSCs 的抑制作用

研究表明miR-30b在CD24、CD44和EPCAM三陽性胰腺癌干細胞中明顯下調(diào)，miR-30b可通過靶向Snail以抑制PCSCs的上皮間質(zhì)轉化[28]。然而，之前的研究卻認為miR-30b對CD133陽性胰腺癌干細胞的遷移及侵襲有促進作用[23]，表明miR-30b對于具有不同表面標志物的胰腺癌干細胞可能具有不同的調(diào)控作用。Jiang等[29]發(fā)現(xiàn)miR-1181在胰腺癌組織和細胞中表達明顯下調(diào)，低表達的miR-1181與胰腺癌患者整體生存率和無病生存率較低有關，通過對miR-1181的上調(diào)及下調(diào)證實miR-1181對PCSCs具有重要的調(diào)控作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這一調(diào)控作用與miR-1181直接靶向抑制胰腺癌腫瘤干細胞中的轉化因子（SOX2）和信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）的表達有關[29]。

一項研究中發(fā)現(xiàn)在胰腺非腫瘤干細胞中靶向抑制miR-17-92的表達可使這些細胞具有腫瘤干細胞樣特征，如CD133的上調(diào)、腫瘤細胞的自我更新能力增強和隨后的體外化療抵抗[30]。更重要的是，miR-17-92的過度表達靶向多個信NODAL/ACTIVIN/TGF-beta1的級聯(lián)成員以及直接抑制下游靶點p21、p57和tbx3，降低了腫瘤干細胞的自我更新能力、體內(nèi)腫瘤發(fā)生率和化療耐藥性，因此認為mirR-17-92在胰腺癌干細胞中具有重要的抑制作用[30]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1對胰腺癌干細胞的維持作用是通過介導miR-17-92簇（由6個成員組成miR-17、18a、19a、19b、20a和92a）的甲基化來實現(xiàn)的[31]。

Ji等[32]研究表明miR-34通過調(diào)節(jié)其下游靶點Bcl-2和Notch，參與PCSCs的自我更新，在CD44+/CD133+胰腺癌細胞中提高miR-34的表達可顯著抑制腫瘤生長以及體內(nèi)腫瘤形成。最近，miR-137在CD133+胰腺癌細胞中的作用也被揭示出。He等[33]發(fā)現(xiàn)KLF12可作為miR-137靶點抑制胰腺癌的CSCs表型,且這一過程又與Wnt/beta-catenin信號通路相關，表明miRNA-137可能通過靶向KLF12抑制Wnt/beta-catenin信號通路降低胰腺癌細胞的干細胞特性。

在CD24+CD44+ESA+胰腺癌細胞中，miR-200c的過度表達通過抑制EMT對人PCSCs具有抑制作用[34-35]。表現(xiàn)為，轉錄因子ZEB1和Vimentin（間充質(zhì)細胞標記物）的表達明顯下調(diào)，E-鈣粘蛋白（上皮細胞標記物）的表達上調(diào)，菌落形成、侵襲、化療抵抗和異種移植生長下降。此外，miR-200a表達的缺失與EMT表型和干細胞特征相關，其特征在于細胞表面標志物CD24、CD44和ESA的表達增高[36]。

Gao等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中miR-335能夠抑制OCT4陽性腫瘤干細胞的形成，OCT4被鑒定并確認為miR-335的直接功能靶點，這意味著miR-335可能抑制以OCT4為靶點的胰腺癌的進展和干細胞特性。此外miR-205的過度表達，在胰腺癌干細胞中亦具有抑制作用[38]。

表1 PCSCs 中異常表達的miRNATable 1 Summary of miRNAs dysregulated in PCSCs

4 PCSCs 相關治療策略

近年來的研究表明，一些非癌癥相關藥物對不同的人CSCs 具有抗癌作用，也可以作為治療PCSCs的一種選擇。Yin等[39]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對PCSCs具有抑制作用，并且增強了吉西他濱的療效。在術前服用辛伐他汀可降低sonic hedgehog（shh）信號的下游介質(zhì)和進展標志物（cMet,CxCR4 and Vimentin）的表達，表明其可用于預防和共同治療胰腺癌。數(shù)月后Gupta等[40]提出洛伐他?。硪环N降脂藥）聯(lián)合紫杉醇治療可降低CD133+胰腺癌小鼠中的腫瘤體積。此外，二甲雙胍（降糖藥）對CSCs的抑制作用也越來越引起人們的關注，使用各種癌癥模型（包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和結腸癌）的研究已經(jīng)證明了二甲雙胍可通過靶向細胞分化、更新、轉移和代謝的特定途徑減輕CSCs的作用[41]。對于替吉環(huán)素（抗生素），最初是針對某些細菌的抗生素耐藥性而開發(fā)的，后來卻發(fā)現(xiàn)其可減少胰腺癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌中CSCs的球形形成[42]。

由于PCSCs中的信號通路及表面標志物對腫瘤的生長、侵襲、轉移等具有重要的調(diào)節(jié)作用，因此可作為胰腺癌的潛在治療靶點。一項研究顯示，DCLK1抑制劑可抑制CHK1的磷酸化，與在細胞系模型中單獨使用吉西他濱相比，聯(lián)合使用吉西他濱和DCLK1抑制劑使胰腺癌患者的細胞存活率顯著降低[43]。Ma等[44]發(fā)現(xiàn)shh的抑制藥血根堿可通過抑制shh通路從而抑制PCSCs的自我更新、遷移及侵襲。另外，靶向藥藤黃酚同樣能顯著抑制PCSCs細胞的自我更新和降低轉移潛能，其作用機制是通過調(diào)節(jié)miR-200c下調(diào)Notch1信號[45]。

5 展 望

PCSCs是胰腺癌發(fā)生、轉移及耐藥的主要原因。miRNA對PCSCs具有重要的促進或抑制作用，深入研究miRNA 對PCSCs 生物學行為的調(diào)控作用，這將有助于發(fā)現(xiàn)PCSCs的起源、自我更新機制和胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關鍵機制，也有助于研發(fā)更好的胰腺癌治療靶點。相信隨著研究的深入，以miRNA為靶分子改變PCSCs的生物學特性的腫瘤治療策略有望實現(xiàn)。