紫草素對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷的抑制作用

王澤普，彭彥輝，脫紅芳，胡湧渤

（河北省人民醫(yī)院 1.肝膽外科 2.醫(yī)務(wù)處，河北 石家莊 050057）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床常見的急腹癥，嚴(yán)重者可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征，發(fā)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），病情兇險(xiǎn)，病程復(fù)雜。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是SAP的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。超過50%的SAP患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥[1]。SAP早期死亡患者中，60%死于呼吸衰竭[2]。IL-6、TNF-α是參與SAP并發(fā)ALI時(shí)的重要炎癥因子，可以預(yù)測(cè)ALI的進(jìn)展[3]。很多研究已表明，PI3K/Akt、NF-κB是與ALI發(fā)展相關(guān)的下游炎性信號(hào)通路，下調(diào)PI3K/Akt和NF-κB的活化可降低?；悄懰徕c誘導(dǎo)的ALI大鼠的促炎細(xì)胞因子水平[4]。亦有研究發(fā)現(xiàn)使用PI3K/Akt抑制劑可降低敗血癥模型小鼠的血清炎性因子水平，增加小鼠的生存率[5-6]。

紫草素是存在于植物紫草根中的一種萘醌類化合物。近年來，多項(xiàng)研究[7-8]表明紫草素對(duì)關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病及敗血癥等炎癥反應(yīng)有很好的治療作用。其機(jī)制可能與下調(diào)白三烯B4的合成、抑制肥大細(xì)胞去顆粒作用、抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，破壞磷脂酰肌醇信號(hào)通路和下調(diào)NF-κB活化等有關(guān)[9]。Bai等[10-11]證實(shí)，紫草素可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷小鼠肺組織NF-κB活化，減少TNF-α的產(chǎn)生。也有研究[12]發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制PI3K和Akt的磷酸化。那么，紫草素對(duì)SAP及其并發(fā)的ALI是否有類似治療作用及其機(jī)制尚未明確。本研究旨在明確紫草素在SAP及其并發(fā)的ALI中的作用，并探討其與PI3K/Akt、NF-κB之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

健康雄性清潔級(jí)S D 大鼠24 只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，紫草素、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司），兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、NF-κB多克隆抗體（美國(guó)Bioworld Technology公司），?；悄懰徕c（Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，急性胰腺炎組（模型組），紫草素治療組（治療組），每組8 只。各組SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。治療組于造模前2 h 給予紫草素（50 mg/kg，溶于0.25 mL 二甲基亞砜）灌胃，模型組、對(duì)照組于同時(shí)間給予等量二甲基亞砜灌胃。模型組、治療組經(jīng)3% 戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射（0.2 mL/100 g）麻醉，腹正中切口，于主胰管開口附近十二指腸系膜對(duì)緣使用1 mL 注射器針頭刺穿腸壁，鈍頭1 mL 注射器針頭經(jīng)十二指腸乳頭插入胰膽管，無損傷動(dòng)脈夾固定，于肝門處用無損傷動(dòng)脈夾夾閉胰膽管，經(jīng)針頭注入4% 牛磺膽酸鈉（0.1 mL/100 g，注射速度0.2 mL/min），5 min后松開動(dòng)脈夾，拔出針頭，縫合十二指腸壁，關(guān)閉腹腔，背部皮下注射2 mL 生理鹽水，補(bǔ)充手術(shù)損失。對(duì)照組經(jīng)同種方式麻醉進(jìn)腹后僅顯露、牽拉十二指腸即關(guān)腹。術(shù)后各組大鼠禁食不禁水，于造模后6 h 取血、處死取材。

1.2.2 取材 剖開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，靜置3 h 后于離心機(jī)3000 r/min 離心15 min，用于TNF-α、IL-6 水平檢測(cè)。取大鼠胰腺組織與肺組織，其中右下肺組織及胰腺脾側(cè)葉經(jīng)10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE 染色，制備肺組織、胰腺組織病理切片用于形態(tài)學(xué)觀察；其余肺組織用于肺組織濕干與PI3K、p-PI3K 和NF-κB 表達(dá)檢測(cè)。

1.2.3 血清TNF-α、IL-6 濃度測(cè)定按照TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒步驟操作測(cè)定血清TNF-α、IL-6 水平。

1.2.4 肺組織及胰腺組織損傷評(píng)分 胰腺組織損傷評(píng)分根據(jù)Schmidt's 方法進(jìn)行評(píng)分（表1）。肺損傷顯微鏡下嚴(yán)重程度分級(jí)：根據(jù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)及肺泡間隙、間質(zhì)水腫和廣泛的肺泡壁增厚程度進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)5 個(gè)等級(jí)0、1、2、3、4。

表1 胰腺損傷Schimdt's 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Schimdt's scoring criteria for pancreatic injury

1.2.5 肺組織濕干比測(cè)定 取左上肺組織用電子稱稱其濕重，置于80 ℃烘烤箱24 h，稱其干重，計(jì)算肺組織的濕干重比。

1.2.6 肺組織PI3K、p-PI3K 和NF-κB 的表達(dá) 用Western blot 法檢測(cè)肺組織中PI3K、p-PI3K 和NF-κB 蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)處理均應(yīng)用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

胰腺組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組大鼠胰腺組織無明顯水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死；模型組大鼠胰腺組織可見胰腺腺泡水腫，伴有顯著的小葉間隙增寬及片狀壞死，實(shí)質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)可見明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組胰腺組織較模型組胰腺組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腺泡水腫程度減輕，炎癥程度減輕，未見明顯壞死灶。與對(duì)照組比較，模型組與治療組胰腺組織病理評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。肺組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組肺組織鏡下無明顯形態(tài)學(xué)變化；模型組鏡下肺組織可見明顯的形態(tài)學(xué)異常，包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)及肺泡間隙、間質(zhì)水腫和廣泛的肺泡壁增厚；治療組鏡下肺組織損傷嚴(yán)重程度較模型組減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型組明顯減輕。與對(duì)照組比較，模型組與治療組肺組織病理評(píng)分均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）（圖1）（表2）。

2.2 血清TNF-α、IL-6 濃度檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組與治療組血清TNF-α、IL-6 濃度均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；與模型組相比，治療組血清TNF-α、IL-6濃度均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

圖1 HE 染色結(jié)果（×100）Figure 1 Results of HE staining (×100)

表2 各組胰腺與肺組織病理評(píng)分比較（±s，n=8）Table 2 Comparison of the pathological scores for pancreatic and lung tissue among groups (±s,n=8)

表2 各組胰腺與肺組織病理評(píng)分比較（±s，n=8）Table 2 Comparison of the pathological scores for pancreatic and lung tissue among groups (±s,n=8)

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.control group;2) P＜0.05 vs.model group

病理評(píng)分 對(duì)照組 模型組 治療組胰腺 07.00±0.421) 4.12±0.351),2)肺06.75±0.361) 3.50±0.321),2)

表3 各組血清TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n=8）Table 3 Comparison of the serum levels of TNF-α and IL-6 among groups (±s,n=8)

表3 各組血清TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n=8）Table 3 Comparison of the serum levels of TNF-α and IL-6 among groups (±s,n=8)

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05Note:1) P＜0.05 vs.control group;2) P＜0.05 vs.model group

炎癥因子 對(duì)照組 模型組 治療組IL-6（pg/mL） 113.98±15.52342.60±14.781) 227.33±17.971),2)TNF-α（pg/mL） 95.29±15.81306.38±16.051) 196.08±19.141),2)

2.3 肺組織濕干比檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組，模型組、治療組肺組織濕干比分別為：4.90±0.21、6.88±0.16、5.96±0.13。與對(duì)照組比較，模型組、治療組肺組織濕干比均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；治療組肺組織濕干比與模型組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.4 肺組織p-PI3K/PI3K、NF-κB 表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組、治療組p-PI3K/PI3K比值及NF-κB表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，治療組p-PI3K/PI3K比值及NF-κB表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）。

3 討 論

SAP早期胰外器官損傷中，ALI最為突出。ALI是全身炎癥反應(yīng)的結(jié)果，但SAP引起ALI的具體機(jī)制并未完全闡明。其可能的病理生理機(jī)制包括各種體內(nèi)平衡的紊亂、炎癥反應(yīng)、肺血管內(nèi)皮和上皮屏障功能障礙等[13]。在ALI發(fā)病早期，炎癥細(xì)胞向肺部聚集、浸潤(rùn)，并釋放大量炎性介質(zhì)（如白介素類、TNF-α、彈性蛋白酶及氧自由基等），這些炎癥細(xì)胞及炎癥因子在某種炎癥通路的串聯(lián)下相互作用；如能在早期實(shí)施干預(yù)，調(diào)控有關(guān)信號(hào)通路的活性變化，將對(duì)SAP并發(fā)ALI的治療起到重要作用[14]。

圖2 各組Western blot 檢測(cè)結(jié)果 Figure 2 Results of Western blot of each group

TNF-α是AP發(fā)病后較早期產(chǎn)生的細(xì)胞因子，通過誘生炎癥介質(zhì)、激活中性粒細(xì)胞產(chǎn)生間接毒性作用[15]。IL-6是在急性應(yīng)激狀態(tài)下由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞釋放的一種炎性因子，在SAP患者中，IL-6的表達(dá)與ALI的嚴(yán)重程度相關(guān)，是預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的良好指標(biāo)[16]。在該研究中，模型組血清TNF-α、IL-6水平明顯高于對(duì)照組，而紫草素治療組血清TNF-α、IL-6水平較模型組降低；治療組肺組織濕干比較模型組低，治療組肺組織損傷評(píng)分及胰腺組織損傷評(píng)分均較模型組輕，說明紫草素可減輕SAP并發(fā)ALI的炎癥反應(yīng)。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可被多種因子激活，參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并起到廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[17-18]。NF-κB信號(hào)通路在炎癥、代謝、肺血管屏障功能障礙等炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的“炎癥轉(zhuǎn)換”作用[19]。活化的NF-κB在SAP的發(fā)生中起著重要的作用，它參與對(duì)細(xì)胞因子、黏附分子、炎性因子和免疫的調(diào)節(jié)。有研究[20-21]已證實(shí)，PI3K/Akt和NF-κB炎癥信號(hào)通路的活化是ALI發(fā)展的潛在分子機(jī)制。也有研究[22]發(fā)現(xiàn)對(duì)敲除PI3K基因的小鼠能減輕自身所發(fā)生的炎癥反應(yīng)。本研究中，模型組大鼠肺組織p-PI3K、NF-κB表達(dá)升高，證實(shí)了PI3K的磷酸化及NF-κB信號(hào)通路的活化在SAP并發(fā)的ALI中發(fā)揮重要的作用。紫草素治療組大鼠肺組織中PI3K的磷酸化及NF-κB的表達(dá)明顯低于模型組，說明紫草素對(duì)SAP的ALI有一定預(yù)防作用，并且此作用很可能與抑制PI3K的磷酸化及NF-κB的活化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，紫草素對(duì)牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)的SAP并發(fā)肺損傷大鼠進(jìn)行預(yù)處理能夠明顯抑制胰腺組織與肺組織的損傷，能顯著降低SAP大鼠血清TNF-α及IL-6水平，下調(diào)p-PI3K及NF-κB在肺組織中的表達(dá)，提示在SAP并發(fā)ALI過程中，炎性因子如TNF-α、IL-6大量釋放，PI3K/Akt和NF-κB炎癥信號(hào)通路被激活；而紫草素治療可降低血清炎性因子TNF-α、IL-6的水平，下調(diào)PI3K的磷酸化及NF-κB在肺組織中的表達(dá)。因此，紫草素對(duì)大鼠的SAP及其并發(fā)的ALI均有抑制作用，其機(jī)制可能與減少炎癥因子的釋放以及降低肺組織PI3KAkt-NF-κB通路活化有關(guān)。