血紅素氧合酶1在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

劉海潮，劉少朋，白明輝，蘇寶威

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院 肝膽?zhàn)薅?，河?洛陽(yáng) 471000）

胰腺癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率高，病死率高，預(yù)后差[1-2]。胰腺癌治療方法眾多，如外科手術(shù)、藥物化療、放療、射頻消融、微波消融、納米刀消融、冷凍等，但基于胰腺癌較高的惡性生物學(xué)行為，轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高，治療效果仍不理想[3-6]。隨著生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人類(lèi)對(duì)腫瘤的探索已邁入生物分子時(shí)代，更加注重對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相關(guān)研究。血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）是人體代謝中的重要成分，可分為3型，其中，血紅素氧合酶1（heme oxygenase，HO-1）又被稱為熱休克蛋白32（HSP-32），它既是一種誘導(dǎo)型微粒體催化酶，又是一種促進(jìn)分解代謝的限速酶[7]，廣泛參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)，具有抗氧化、保護(hù)重要組織、器官及細(xì)胞的功能[8]。研究[9-11]顯示，HO-1同時(shí)也參與了細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、進(jìn)展等重要途徑。但截至目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于HO-1在胰腺癌中的研究較少?；谝陨弦蛩兀狙芯客ㄟ^(guò)不同方法檢測(cè)胰腺癌組織中HO-1的表達(dá)情況，并分析其與胰腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后間的關(guān)系，以期為后續(xù)研究提供一定參考，并尋找胰腺癌治療可能潛在的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2019年1月期間在我院普外科診治的80例行手術(shù)切除的胰腺癌患者為研究對(duì)象。收集癌組織及癌旁組織（距癌灶邊緣＞2 cm）納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)前未行化療、放療等輔助治療；⑵ 手術(shù)可切除，且術(shù)后經(jīng)兩名病理科醫(yī)師行病理學(xué)閱片證實(shí)為胰腺癌；⑶ 未合并其他臟器轉(zhuǎn)移；⑷ 患者一般情況良好，能耐受手術(shù)，無(wú)明顯心、腦、肺臟器疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)前行化療、放療等相關(guān)輔助治療；⑵ 術(shù)前合并遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移；⑶ 患者無(wú)法耐受手術(shù)；⑷ 依從性差，不能規(guī)律隨訪者。本研究資料完整，無(wú)失訪，且征得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HO-1 的表達(dá) 術(shù)后標(biāo)本經(jīng)處理后，以10% 甲醛固定并行石蠟包埋，切片機(jī)4 μm 連續(xù)切片（同一標(biāo)本均切4 張），65 ℃烤片、二甲苯脫蠟、水化。EDTA 修復(fù)液高壓修復(fù)2 min，PBS 試劑洗滌3 次，加入過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（30 ml/L），37 ℃室溫孵育后用羊血清封閉20 min。濾紙吸凈周?chē)鷼堄酀B液，加入兔抗人HO-1 多克隆抗體（1:500）為一抗，再滴加PBS 試劑重復(fù)以上操作（空白對(duì)照），置4 ℃冰箱過(guò)夜，再加入生物素化山羊抗兔IgG 為二抗，恒溫37 ℃烤箱30 min，再次PBS 沖洗3 次，室溫下二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色7 min，清水沖洗后蘇木素復(fù)染。乙醇脫水并中性樹(shù)膠封片后行鏡下觀察。

1.2.2 Western blot 法檢測(cè)HO-1 的表達(dá) 分別提取兩組組織蛋白，Bradford 比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，分別加入同等濃度的細(xì)胞裂解液和緩沖液，沸水煮沸3 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度：分別取100 μg 樣品上樣，行凝膠電泳、脫脂后加入一抗，室溫過(guò)夜后行TBST 沖洗3 次（15 min/ 次），加入適量辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG 二抗，室溫孵育1 h 后再行TBST 沖洗3 次。ECL 試劑盒顯影，并用掃描儀對(duì)底片進(jìn)行透掃，對(duì)結(jié)果行灰度分析。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 依據(jù)Thomas 綜合計(jì)分法[12]，在光鏡（×400）下每個(gè)切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，觀察染色強(qiáng)度及染色廣度（陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比）。染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分（無(wú)色），1 分（淡黃色），2 分（棕黃色），3 分（黃褐色）；染色廣度評(píng)分：0 分（0～10%），1 分（11%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4 分（76%～100%）。以染色強(qiáng)度法+ 染色廣度法綜合積分進(jìn)行評(píng)判：0～4 分：陰性表達(dá)（-）；5～12 分：陽(yáng)性表達(dá)（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，定量資料的比較采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)或單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法。組間相關(guān)關(guān)系比較采用Pearson相關(guān)分析，生存期比較采用Log-rank檢驗(yàn)，SPSS繪制生存曲線。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺癌組織及癌旁組織中HO-1 的表達(dá)情況

光鏡下顯示，HO-1主要表達(dá)在胰腺癌細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色。HO-1在胰腺癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率為78.75%（63/80），而在周?chē)┡越M織中表達(dá)陽(yáng)性率為11.25%（9/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）（表1）。

圖1 免疫組織化檢測(cè)HO-1 的表達(dá)（×200） Figure 1 Immunohistochemical staining for HO-1 expression (×200)

表1 胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織中HO-1 的表達(dá)情況[n（%）]Table 1 HO-1 expressions in pancreatic cancer tissue and adjacent normal pancreatic tissue [n (%)]

2.2 Western blot 法檢測(cè)胰腺癌組織及癌旁組織中HO-1 的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，胰腺癌組織中HO-1的表達(dá)量較于癌旁胰腺組織明顯升高，定量分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 HO-1 蛋白的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

HO-1蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡及CA19-9的高低無(wú)關(guān)（均P＞0.05），但與TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）；TNM分期越晚、腫瘤分化程度越低及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，HO-1的陽(yáng)性率越高（表2）。

圖2 胰腺癌組織及癌旁組織中HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較Figure 2 Comparison of the relative expression levels of HO-1 protein in pancreatic cancer tissue and tumor adjacent tissue

表2 HO-1蛋白的表達(dá)與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of HO-1 expression with the clinicopathologic features of pancreatic cancer [n (%)]

2.4 HO-1 蛋白的表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系

所有研究者均隨訪至2019年6月。Log-rank檢驗(yàn)示，HO-1陽(yáng)性表達(dá)的63例胰腺癌患者中位生存期為25.1個(gè)月，而剩余的17例HO-1表達(dá)陰性的胰腺癌患者中位生存期為36.7個(gè)月，明顯優(yōu)于前者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 HO-1 陽(yáng)性及陰性表達(dá)的胰腺癌患者的生存曲線Figure 3 Survival curves of pancreatic cancer patients with positive and negative HO-1 expressions

3 討 論

作為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，胰腺癌發(fā)病率高，惡性程度高，且病死率高，被稱為“癌中之王”[13-14]。以外科手術(shù)為主的治療方法極大的提高了胰腺癌患者的生存率，但由于胰腺為腹膜后器官，位置深在，發(fā)病隱匿，且胰腺癌缺乏典型的臨床表現(xiàn)，因此多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，多已喪失外科手術(shù)時(shí)機(jī)[15]。對(duì)于中晚期胰腺癌患者，藥物化療是主要的治療方法之一，但 由于腫瘤發(fā)生是多分子通路相互作用的過(guò)程，癌細(xì)胞基因突變多，易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，化療敏感性差[16-18]。因此，基于分子層面而不斷尋求新的藥物治療潛在靶點(diǎn)就顯得尤為重要。相關(guān)研究[19-21]已證實(shí)，HO-1是人體抵抗應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分，可將血紅素分解為膽綠素及一氧化碳等，進(jìn)而分解為膽紅素，參與機(jī)體代謝、氧化還原反應(yīng)過(guò)程。研究[22-24]發(fā)現(xiàn)，HO-1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、急性腎損傷、急性腦梗死等疾病進(jìn)展過(guò)程中具有抗氧化、減輕應(yīng)激反應(yīng)的作用。但與此同時(shí)，目前國(guó)內(nèi)外研究也顯示，HO-1 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有促進(jìn)作用，Ren等[25]發(fā)現(xiàn)，HO-1 其在胃癌上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中明顯高表達(dá)，有可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。此外，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了HO-1 的高表達(dá)狀態(tài)[26-28]，這提示HO-1可能作為一種促癌基因，廣泛參與了諸多腫瘤的進(jìn)展。在胰腺癌中，國(guó)外Abdalla等[29]研究提示，抑制HO-1可降低干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44的表達(dá)，可用于胰腺癌患者的治療。Nuhn等[30]發(fā)現(xiàn)，抑制HO-1和鐵在胰腺癌細(xì)胞中的螯合作用與胰腺腫瘤對(duì)體內(nèi)化療的敏感性增加有關(guān)，可能為胰腺癌的治療提供新的策略。但截至目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于HO-1在胰腺癌發(fā)病過(guò)程中的相關(guān)研究卻較少，因此本課題結(jié)合目前已有研究成果，著重探究了HO-1在胰腺癌組織中的表達(dá)，分析其與胰腺癌患者的臨床預(yù)后相關(guān)性，以便為后續(xù)更多研究提供參考。

3.1 免疫組化法及Western blot 法檢測(cè)HO-1 在胰腺癌組織中的表達(dá)

免疫組化法顯示，HO-1 主要表達(dá)于胰腺細(xì)胞質(zhì)中，且在胰腺癌中呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為78.75%，而在癌旁正常胰腺組織中呈明顯低表達(dá)，陽(yáng)性率為11.25%，兩組患者差異顯著，說(shuō)明HO-1可能參與并促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生，這與蔣潔等[31]的研究結(jié)果類(lèi)似。Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中HO-1表達(dá)量顯著高于癌旁正常胰腺組織。這與免疫組化法結(jié)果保持一致，更進(jìn)一步提示HO-1與胰腺癌關(guān)系密切，且可能與胰腺癌的發(fā)展有協(xié)同作用。藥物化療的機(jī)理是細(xì)胞毒性藥物作用于腫瘤的發(fā)生發(fā)展通路，進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展。基于以上因素，作者猜測(cè)抑制HO-1的表達(dá)，可能有助于抑制胰腺癌的進(jìn)展，進(jìn)而為胰腺癌的治療提供新的分子靶點(diǎn)。本課題后續(xù)研究將對(duì)此進(jìn)行著重探究。

3.2 HO-1 的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

分析HO-1與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，HO-1與患者性別、年齡及CA19-9的表達(dá)無(wú)關(guān)，但與胰腺癌TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且TNM分期越晚、腫瘤分化程度越低和（或）發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，HO-1的表達(dá)量呈明顯升高趨勢(shì)。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)研究，提示HO-1不僅參與了胰腺癌的發(fā)生，且與胰腺癌患者的臨床病理特征具有顯著相關(guān)性，可能促進(jìn)了胰腺癌的進(jìn)展，這與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果類(lèi)似[32-33]。胰腺癌TNM分期越晚、腫瘤分化程度越低者，則預(yù)后越差，而HO-1與胰腺癌臨床病理特征顯著相關(guān)，因此，隨著研究深入，檢測(cè)HO-1的表達(dá)可能成為預(yù)測(cè)胰腺癌進(jìn)展的又一新指標(biāo)。

3.3 HO-1 的表達(dá)與胰腺癌患者生存期的相關(guān)性分析

隨后的Log-rank 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HO-1 表達(dá)陽(yáng)性的胰腺癌患者中位生存期為25.1個(gè)月，顯著短于HO-1表達(dá)陰性的胰腺癌患者，說(shuō)明HO-1的表達(dá)與胰腺癌患者的生存期關(guān)系密切，這對(duì)臨床治療中判定胰腺癌患者的預(yù)后起到了一定的參考價(jià)值。

總之，本課題發(fā)現(xiàn)HO-1 在胰腺癌中呈高表達(dá)，且與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后具有高度相關(guān)性，揭示了其有可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了某種協(xié)同促進(jìn)作用，對(duì)胰腺癌的診治及預(yù)后判斷具有一定的參考價(jià)值，有可能成為胰腺癌藥物化療潛在的新靶點(diǎn)。但本研究周期短、樣本量小，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)HO-1在胰腺癌細(xì)胞增殖等過(guò)程中的具體作用機(jī)制進(jìn)行更加深入研究，以期進(jìn)一步探究其內(nèi)在作用機(jī)制，為臨床治療提供一定參考。