基因敲除技術在微生物中的應用

王 雪,黃建忠，李 力

(福建師范大學 生命科學學院,福建 福州 350108)

基因敲除技術，又名基因打靶，自20世紀80年代發(fā)展起來，主要建立在同源重組的基礎上，屬于一種新型分子生物學技術。經(jīng)典的基因敲除技術是指通過同源重組原理將標記基因定點地整合入目標細胞基因組上某一特定的位點，以達到細胞內(nèi)某一目的基因敲除的一種技術?；蚯贸夹g已經(jīng)廣泛應用于動植物、微生物，應用形式多種多樣，主要有同源重組法、隨機插入突變法、RNA干擾法、ZFNs法、TALEs法，此外，還有目前熱點研究的CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因敲除技術。基于同源重組的基因敲除技術主要有RecA系統(tǒng)同源重組法、Red系統(tǒng)同源重組法、基于自殺載體的同源重組法、基于溫敏型質(zhì)粒的同源重組法。這四種方法各有優(yōu)缺點，要根據(jù)不同的微生物不同的條件選擇不同的方法，其基本原理如圖1。基因敲除技術的熱門也使得一大批發(fā)明專利涌現(xiàn)。本文對幾種廣泛應用于微生物的基因敲除方法進行介紹，并提供一些成功案例及發(fā)明專利，各種方法的比較見表1。

圖1 同源重組法進行基因敲除的一般原理Fig.1 Ceneral principles of gene knockout by homologous recombination

表1 基因敲除方法的比較Table 1 Comparison of gene knockout methods

注：“-”表示無特定質(zhì)粒

1 基因敲除技術原理

1.1 RecA系統(tǒng)同源重組法

RecA同源重組系統(tǒng)是大腸埃希菌中的內(nèi)源性同源重組機制，組成它的蛋白質(zhì)包括RecA蛋白和RecBCD等[1]。RecA具有雙重功能，它不但能改變單鏈的DNA分子還可以激活蛋白酶，是大腸埃希菌recA基因座的產(chǎn)物，具有單、多聚體兩種形式，可以參與大腸埃希菌中任何同源重組機制。RecA蛋白是纖維狀的，能夠參與DNA損傷的修復，總的來說，它有兩個主要功能，一是能夠促進DNA分子鏈之間的交換，二是作為共蛋白酶可以促進阻遏蛋白LexA的自我水解，蛋白RecBCD就是三種蛋白質(zhì)RecB、RecC、RecD的復合體，這三種蛋白質(zhì)可以解開DNA雙鏈，在Chi位點處形成DNA單鏈[2]。但是通過RecA系統(tǒng)難以成功獲得基因缺失突變株，其具有以下3個缺點：①重組的概率很低；②構(gòu)建重組載體時需要的同源臂較長；③RecBCD蛋白具有核酸外切酶的活性，可以降解線性的DNA片段給替換載體的構(gòu)建帶來了困難。因此，由于RecA同源重組系統(tǒng)需要依賴于特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點，并且需要的同源臂較長，具有操作復雜等缺點，現(xiàn)已很少被使用[3]。

1.2 Red系統(tǒng)同源重組法

Red重組系統(tǒng)來源于λ噬菌體，包括Exo、Beta、Gam3三種蛋白質(zhì)，進行基因敲除時將編碼這三種蛋白質(zhì)的基因克隆入載體，利用基因翻譯成相應的蛋白質(zhì)，使得同源基因重組能夠順利進行。在這三種蛋白質(zhì)中Exo蛋白具有λ核酸外切酶活性，能夠從DNA單鏈的5′端向3′端降解，最后產(chǎn)生3′突出末端而Beta蛋白恰能與這個有3′突出末端的DNA片段結(jié)合，介導其互補鏈的退火且保護這個DNA分子不被降解，最重要的是Exo蛋白有重組酶活性可以促使同源重組，Gam蛋白的作用則是防止導入目的菌株的DNA分子被核酸外切酶降解，其分子量約為16 000 Da，與核酸外切酶結(jié)合能夠有效抑制核酸外切酶的活性[4]。微生物在Red系統(tǒng)的作用下能夠明顯提高同源重組發(fā)生的概率，具有效率高的優(yōu)點。2000年首創(chuàng)兩步同源重組法，在輔助性質(zhì)粒pKD46中表達Red同源重組系統(tǒng)，在構(gòu)建質(zhì)粒載體的過程中，設計引物所需的同源臂長度得到了大大縮短，克服了RecA系統(tǒng)同源重組法復雜、同源臂長的缺點[5]。Red同源重組技術的主要研究對象是大腸埃希菌，但同時它還能夠應用于其他細菌甚至病毒中，兩步同源重組法是Red系統(tǒng)同源重組方法中最經(jīng)典的方法，該方法目前得到廣泛應用。所謂兩步同源重組法就是第一步同源重組質(zhì)粒與染色體上的靶基因進行替換，第二步利用pCP20質(zhì)粒將抗性基因敲除掉。下面就兩步同源重組法的一般策略加以說明：①將帶有Red重組系統(tǒng)的pKD46質(zhì)粒導入目的菌株，使目的菌株能夠產(chǎn)生三種蛋白重組酶，為基因敲除做準備；②構(gòu)建重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒兩側(cè)有靶基因的上下游同源臂，中間是一段抗性基因，含有FRT位點；③制備感受態(tài)細胞，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)法導入目的菌株的感受態(tài)細胞中，要事先加入L-阿拉伯糖，它可以誘導Red重組系統(tǒng)中三種蛋白質(zhì)的表達，促進同源重組；④在LB培養(yǎng)基上加入相應的抗性基因，進行重組子的篩選，能夠在加有抗生素的LB培養(yǎng)基上生長的菌株就是發(fā)生了基因敲除的突變體；⑤將溫敏型質(zhì)粒pCP20導入突變菌株中，用來消除抗性基因；⑥42 ℃培養(yǎng)24 h以上，去除溫敏型質(zhì)粒pKD46。Wang等[6]利用兩步同源重組法成功敲除了畢赤酵母中α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(ochlp)基因，得到ochl基因缺失突變株，研究了融合蛋白(HAS/GM-CSE)的表達。兩步同源重組法只是Red系統(tǒng)重組法中最為重要最為經(jīng)典的一種，在此基礎上又發(fā)展出其他一些方法，比如雙質(zhì)?；蚯贸ā钨|(zhì)?；蚯贸ǎ^兩步同源重組法又有一些新的優(yōu)點，雙質(zhì)?；蚯贸ㄓ脙蓚€質(zhì)粒，其中一個為輔助性質(zhì)粒，另一個為供體質(zhì)粒。單基因敲除法只需一個質(zhì)粒就能完成敲除，在染色體上沒有殘余序列。

在實際的基因敲除操作中往往都是Red兩步同源重組法的延伸，根據(jù)不同的菌株與操作條件適當取舍。蘇莉等[7]采用Red重組方法依次對腸出血性大腸埃希菌(EHEC)O157∶H7的Z1444和Z0986基因進行敲除，成功構(gòu)建出敲除卡那霉素抗性基因的雙缺失突變株。楊冬美等[8]從野生型菌株E.coliW3110出發(fā)，利用Red系統(tǒng)同源重組法，將大腸埃希菌tdcC、sstT、和livJ系統(tǒng)基因敲除，得到單缺失和雙缺失菌株，考察了相應系統(tǒng)缺失對胞外L-蘇氨酸積累的影響。Shi等[9]采用Red系統(tǒng)同源重組，對絲氨酸吸收系統(tǒng)進行多基因敲除，得到單基因敲除、雙基因敲除及三基因敲除等11個突變菌株，成功考察了對大腸埃希菌產(chǎn)L-絲氨酸的影響。楊益等[10]通過設計長引物，PCR擴增出帶有SAT1flipper的CaCsC1基因敲除盒，對 Red兩步同源重組法加以延伸，成功得到敲除了兩個等位基因的白念珠菌CaCsC1基因缺失株。與傳統(tǒng)的白念珠菌基因敲除方法相比較不需要構(gòu)建克隆載體，比較簡單，用FRT序列替代靶基因，沒有NAT抗性，從而減少外源基因的插入對菌株造成的影響?？偟膩碚f，應用Red同源重組策略主要有四種[11]：①一次篩選：即兩側(cè)為同源臂中間為篩選標記基因的DNA片段與染色體上的靶基因發(fā)生同源重組，篩選標記基因取代靶基因，標記基因留在染色體上；②一次篩選，一次位點專一性重組：這種Red同源重組策略是在一次篩選的基礎上，利用位點特異性重組酶系統(tǒng)去除篩選標記基因，來源于F1噬菌體的cre/loxP系統(tǒng)就可以介導位點特異性DNA重組，此外還有Ftp/FRT重組系統(tǒng)。Tamakawa等[12]通過cre-loxP系統(tǒng)重組法成功對C.utilis基因(CuPDC)進行了敲除。cre-loxP系統(tǒng)主要應用于多倍體的敲除，尤其是在食品酵母基因無痕敲除方面的應用[13]；③一次篩選，一次限制性核酸酶酶切：這種技術也可以將標記基因去除，同時還可以留下一個限制性酶切位點。王立東等[14]在研究乙醛脫氫酶基因?qū)γ鞔榫a(chǎn)甘露醇影響時，首先構(gòu)建了攜帶四環(huán)素抗性基因的同源重組載體，然后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切去除抗性標記基因，產(chǎn)生無抗性標記上的同源重組載體，最終獲得乙醛脫氫酶基因敲除突變菌株；④兩次篩選：構(gòu)建的基因置換載體有兩個篩選標記基因，通常為一個抗性基因，一個致死基因，如sacB有時也稱為反向篩選標記基因。

1.3 基于自殺載體的同源重組法

所謂自殺質(zhì)粒(suicide plasmid)就是指當某一特定質(zhì)粒進入宿主細胞時，要么整合到宿主染色體上，要么因為不能復制而被消除掉，這是因為自殺質(zhì)粒的復制需要一種特殊的蛋白質(zhì)，如果宿主不能夠產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，除非整合到染色體上，那么就不能繼續(xù)存在，這就是自殺質(zhì)粒用來作為基因敲除工具的理論基礎。因此，不同的微生物需要選擇不同的自殺質(zhì)粒，在目的菌株中自殺質(zhì)粒迫于生存的需要，會促使自身與染色體發(fā)生整合，利用一定的方法，將含有目的基因同源臂的DNA片段克隆至自殺載體，這個自殺載體上通常需要兩個篩選標記，一個正篩選標記，一個負篩選標記，當含有同源臂的自殺載體導入目的菌株時，在生存壓力下，自殺載體會與染色體DNA發(fā)生同源重組，即發(fā)生第一輪單交換，而后在負篩選的壓力下發(fā)生第二輪的單交換，最終將基因敲除[15]。常見的自殺載體有pK18mob、pCVD442、pSVP202、pKSV7、pEX18Tc等，各種自殺質(zhì)粒實現(xiàn)自殺的原理不盡相同，如pCVD442是因為大多數(shù)宿主菌體無法產(chǎn)生π蛋白。而自殺質(zhì)粒pKSV7同時也是溫敏型質(zhì)粒。劉武康等[16]利用溫敏型自殺載體pKSV7構(gòu)建重組質(zhì)粒，將單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)這一胞內(nèi)寄生菌的毒力因子內(nèi)化素A(internalinA,InlA)和內(nèi)化素B(internalinB,InlB)基因進行敲除，成功研究了雙基因缺失突變菌株的基本生物學特性。林丹楓等[17]以自殺型質(zhì)粒pSVP202為載體，成功構(gòu)建基因置換質(zhì)粒，敲除類球紅細菌的八氫番茄素合成基因crtB，并引入大腸埃希菌的4-羥苯甲酸轉(zhuǎn)移酶基因ubiA和分支酸裂解酶基因ubiC，提高了類球紅細菌中輔酶Q10的產(chǎn)量。韓武洋等[18]利用自殺載體pKB18mobsacB，采用無抗性標記的同源重組法，成功敲除了野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC10332中編碼葡萄糖pts系統(tǒng)關鍵轉(zhuǎn)運蛋白基因ptsG、ptsH、ptsI和葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)關鍵轉(zhuǎn)運蛋白基因abc、abc2和ioltl，構(gòu)建了谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖代謝阻斷工程菌。

1.4 基于溫敏型質(zhì)粒的同源重組法

溫敏型質(zhì)粒是一種含有溫度敏感型復制子的質(zhì)粒，它在高溫條件下無法復制，在高于37 ℃時會自動去除。比如常見的用于基因敲除的pKC1139、pKD46、pBV220就是溫敏型質(zhì)粒，pKD46含有oriR101溫度敏感型復制元。當帶有目的菌株同源基因的溫敏型質(zhì)粒進入宿主菌株時，在高溫條件下，溫敏型質(zhì)粒迫于生存的壓力，就會與宿主染色體上的同源序列發(fā)生同源重組，利用溫敏型質(zhì)粒的這一特性來對菌株上的目的基因進行敲除，大大提高了成功的概率。四種敲除方法的比較見圖1。段雪梅等[19]利用溫敏型質(zhì)粒pKC1139構(gòu)建重組質(zhì)粒pKT7074，在40 ℃高溫下，迫于生存壓力重組質(zhì)粒pKT7074成功整合到染色體上，取代了靶基因，構(gòu)建出生防菌Act12轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SPA7074缺失突變株。陳暉等[20]以生產(chǎn)氨甲?？敲顾谺工程菌株黑暗鏈霉菌S.tenebrarius312為出發(fā)菌株，同樣利用溫敏型穿梭質(zhì)粒pKC1139，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBZ2，敲除氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因tobZ，得到生產(chǎn)卡那霉素B的工程菌ST314。

1.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因敲除方法

規(guī)律成簇間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是在長期進化過程中形成的一種免疫防御系統(tǒng)，用于抵御外源DNA的入侵[21]，廣泛存在于古細菌和細菌中，是近年來研究的熱點。可以利用這個系統(tǒng)進行基因敲除，關于CRISPR的研究開始于1987年，日本研究人員從大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)長29 bp、間隔32 bp的重復序列[22]。這一發(fā)現(xiàn)并沒有得到足夠重視，經(jīng)過十幾年，隨著越來越多微生物基因組測序工作的完成，人們發(fā)現(xiàn)在許多細菌和古細菌中都存在這樣的重復序列。2002年荷蘭研究者將這些高度同源的間隔重復序列命名為CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，并發(fā)現(xiàn)了與CRISPR相關的基因，即Cas9基因[23-24]。2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列基因與噬菌體和其他外源DNA序列同源，推測間隔序列與生物體抵抗外來入侵有關[25]，2007年通過實驗證明了這一猜想，即CRISPR系統(tǒng)具有免疫防御功能[26]。隨后經(jīng)過許多研究者的不懈努力，CRISPR系統(tǒng)的作用機制與原理逐步被發(fā)現(xiàn)，并將其應用到基因編輯技術中，在線蟲、人類細胞、水稻、擬南芥、斑馬魚、果蠅、釀酒酵母等方面都有應用。CRISPR系統(tǒng)介導的基因編輯技術較其他方法具有編輯效率高、靶向性強、操作簡單等優(yōu)勢，當然也存在不足的地方，如脫靶效應，在一定程度上限制了其廣泛應用[27]，同時也得到越來越多研究者的重視。

目前根據(jù)Cas9蛋白的不同將CRISPR系統(tǒng)主要分為三種類型，分別為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ[28],每一類型又分為多種亞型,這從另一方面也說明了CRISPR系統(tǒng)的多態(tài)性[29]。TypeⅠ的CRISPR系統(tǒng)在細菌與古細菌中都有存在，具有獨特的Cas3蛋白，在三種類型中最為簡單的是TypeⅡ的CRISPR系統(tǒng)，但只存在于細菌中，特有Cas9蛋白，Cas蛋白最少，是進行基因編輯時最常利用的類型,具體結(jié)構(gòu)如圖2。TypeⅢ的CRISPR系統(tǒng)大多在古細菌中發(fā)現(xiàn)，少量發(fā)現(xiàn)于細菌中，含有功能尚不明確的Cas10蛋白與Cas6蛋白，這三種類型的Cas蛋白在抵御外來入侵時各自發(fā)揮著獨特的功能[30]。CRISPR系統(tǒng)之所以能夠應用于基因編輯技術中，是因為它能夠通過引導RNA特異性切割靶序列。2013年通過將CRISPR系統(tǒng)應用于人類和小鼠胚胎干細胞中，實現(xiàn)了多基因的敲除，提高了基因敲除效率[31-32]。

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig.2 CRISPR/Cas9 system structure

2 發(fā)明專利

基因打靶技術應用于生物界的所有領域，在動物學、植物學、微生物學方面都有巨大的應用價值?；蚯贸嚓P研究十分熱門，吸引了很多研究者，得到了許多研究成果及發(fā)明專利，這里對微生物方面最新相關專利方法做一介紹。丁承超等[33]發(fā)明了一種敲除減毒單核細胞增生性李斯特氏菌兩個毒力因子actA和inlB的方法，使減毒后的單核細胞增生李斯特氏菌作為疫苗的載體，從而研究LM食源性致病菌的致病機理，該方法的大致步驟：首先設計引物，利用PCR擴增出actA基因的上下游片段，然后使用限制性內(nèi)切酶進行酶切，采用T4DNA連接酶將酶切后的上下游片段連接，同樣使用限制性內(nèi)切酶將連接好的片段與穿梭質(zhì)粒pKSV7再次進行酶切，T4DNA連接酶再次連接，最后得到重組質(zhì)粒載體，將其導入大腸埃希菌DH5α中，與此同時，要將空質(zhì)粒pKSV7導入大腸埃希菌中作為對照。單核細胞增生李斯特氏菌可引起多種疾病，可以穿越血腦、胎盤屏障，對環(huán)境的耐受能力極強，已引起全世界范圍內(nèi)的關注，成為基因工程疫苗的研究熱點問題，該發(fā)明存在顯著的進步性，敲除了單核細胞增生性李斯特氏菌的兩個毒力因子，使其減毒，可以作為疫苗載體。王瑞明等[34]發(fā)明了一種地衣芽胞桿菌基因快速敲除的方法，整個過程分為四步，首先獲取地衣芽胞桿菌目的基因中一段編碼基因，將其作為同源臂，獲取抗性標記基因，這是必不可少的，經(jīng)過重疊PCR技術，可以將目的基因同源臂序列和抗性標記基因融合在一起，然后進行單酶切，最后轉(zhuǎn)化到目的菌株，即感受態(tài)地衣芽胞桿菌，經(jīng)過一定的培養(yǎng)，得到基因缺失的地衣芽胞桿菌。以前對地衣芽胞桿菌敲除基因時，通常是構(gòu)建兩端基因上下游同源臂中間抗性標記基因的置換質(zhì)粒，進行同源雙交換，這種方法是基于單交換原理，只需進行一次同源重組即可，相比較一般的基因敲除技術，操作簡單，周期較短，敲除效率高，存在很大的進步意義。劉龍等[35]發(fā)明了一種敲除黑曲霉基因的方法，該方法將基因敲除元件與剪切元件都整合到黑曲霉基因組中，只需進行一次轉(zhuǎn)化，在誘導型啟動子的誘導下就能消除抗性基因，該發(fā)明提供了新的方法與思路，可以進行多個基因的敲除。于慧敏等[36]利用重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酰胺酶基因缺失紅球菌的感受態(tài)細胞，得到紅球菌雙基因敲除突變株，公開了一種紅球菌雙基因敲除及高表達腈水解酶的構(gòu)建方法。江福能等[37]利用最近研究較多的CRISPR/Cas9基因敲除技術發(fā)明了一種miR-205基因敲除試劑盒，此外還有一些基因敲除發(fā)明專利較其他方法都存在顯著優(yōu)點。

3 展 望

基因敲除技術是一種重要的基因修飾技術，在各種微生物基因已經(jīng)測定的條件下，對各個基因序列功能的研究就顯得尤為重要，基因敲除技術為研究基因組的功能提供了可能，通過對目的菌株某個基因的敲除，考察該基因?qū)δ康木甑淖饔??；蚯贸夹g的功能在于可以通過構(gòu)建合適的載體選擇性地修飾基因，進而可以控制基因的表達，了解基因的獨特功能，進一步得到人們所需要的產(chǎn)物?；蚯贸夹g在改造動植物、微生物基因組、研究發(fā)育生物學、鑒定新基因新功能、育種以及醫(yī)療領域都有應用價值，并取得了很大進展，基因敲除技術為了解基因組的功能提供了有效的工具，為科學領域的研究帶來一個又一個新的突破，相信在不久的將來，更多新的基因敲除方法將被發(fā)明，現(xiàn)有方法的不足將得到提高與完善，基因敲除操作將變得越來越容易。