畢赤酵母外源蛋白分泌途徑的研究進展

劉 冰，黃志強，鄭 瀟，張建國

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，利用工業(yè)微生物作為表達系統(tǒng)獲得重組蛋白已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、制備抗體、疫苗、工業(yè)用酶及藥用蛋白的重要途徑[1]。目前研究比較深入的重組蛋白表達系統(tǒng)有大腸埃希菌表達系統(tǒng)、枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)、畢赤酵母表達系統(tǒng)、釀酒酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)、哺乳動物表達系統(tǒng)和植物表達系統(tǒng)等[2]，其中畢赤酵母(Komagataellaphaffii)是一種應(yīng)用較為廣泛的真核表達系統(tǒng)，目前已成功表達1 000多種外源蛋白[3]，其中70多種外源蛋白已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)。外源蛋白表達量高是畢赤酵母表達系統(tǒng)的特點之一，羥基腈裂解酶在畢赤酵母胞內(nèi)表達可達22 g/L[4]，膠原蛋白利用畢赤酵母分泌表達可達15 g/L[5]。畢赤酵母的人源化改造消除了重組蛋白的免疫原性[6]。但畢赤酵母表達不同外源蛋白的表達量差異較大[7]，所以，闡明外源蛋白分泌途徑的相關(guān)基因和蛋白質(zhì)及其功能將為改造外源蛋白分泌途徑，提高外源蛋白產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)[8]。近年來，畢赤酵母基因組序列的公布，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，使得闡明外源蛋白分泌過程中相關(guān)基因和蛋白質(zhì)成為可能。利用GeneBank數(shù)據(jù)庫、KEGG生物信息數(shù)據(jù)庫以及兩個基因組(酵母菌屬基因組數(shù)據(jù)庫Saccharomycesgenome database，SGD[9]和酵母的ORCAE系統(tǒng)[10])對蛋白分泌過程進行分析，總結(jié)了畢赤酵母分泌外源蛋白途徑中涉及的基因和蛋白質(zhì)，闡明一個較為完整的外源蛋白分泌途徑。為從分子水平尋找外源蛋白調(diào)控的新靶點，提高外源蛋白表達量提供參考。

1 概 述

目前研究相對較深入的蛋白質(zhì)分泌途徑有Sec分泌途徑、雙精氨酸途徑(Tat)和信號識別顆粒轉(zhuǎn)運途徑。畢赤酵母表達系統(tǒng)將蛋白質(zhì)分泌到胞外主要依靠信號識別顆粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的經(jīng)典途徑，又稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體(ER-Golgi)蛋白分泌途徑(圖1)。這個途徑中目的基因轉(zhuǎn)錄成mRNA后，在細胞質(zhì)中核糖體上合成新生肽鏈；再通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白通道轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中進行折疊和修飾；然后被運送到高爾基體中進一步加工修飾，形成特定結(jié)構(gòu)并具有功能的蛋白質(zhì)；最后通過高爾基體的分泌小泡與質(zhì)膜融合的方式將蛋白質(zhì)分泌到細胞外[11]。

圖1 畢赤酵母的蛋白質(zhì)分泌途徑Fig.1 Secretory pathway of protein from K. phaffii

2 新生肽鏈跨膜靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

根據(jù)mRNA翻譯與新生肽鏈跨膜過程是否同時發(fā)生將新生肽鏈跨膜靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的過程分為“翻譯共轉(zhuǎn)運”和“翻譯后轉(zhuǎn)運”兩種方式[12]。

2.1 翻譯共轉(zhuǎn)運(Co-translational translocation)

新生肽鏈邊合成邊轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的方式稱為翻譯共轉(zhuǎn)運。當新生肽鏈的N端信號肽(Signal peptide，SP)剛在核糖體中合成，即形成核糖體新生肽鏈復(fù)合物(Ribosome-nascent chain complex，RNC)，隨即信號識別顆粒(Signal recognition particle，SRP)通過疏水相互作用與N端信號肽結(jié)合[13-14]，導(dǎo)致新生肽鏈在核糖體的翻譯過程暫停；隨后信號識別顆粒牽引著核糖體新生肽鏈復(fù)合物與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的信號識別顆粒受體(SRP receptor，SR)結(jié)合，然后翻譯過程又重新啟動，同時信號識別顆粒被釋放到細胞質(zhì)中，重新結(jié)合其他新合成的信號肽，進行新一輪的轉(zhuǎn)運[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上存在一個由Sec61復(fù)合體和膜蛋白組成的疏水跨膜通道[16]，新生肽鏈被信號肽牽引著由此通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔[17]。接著信號肽被膜內(nèi)的信號肽酶及其他蛋白酶降解，而新生肽鏈則繼續(xù)延伸直至翻譯完畢。

2.1.1 信號肽 信號肽是新生肽鏈中一段特殊的氨基酸鏈，由10～40個氨基酸殘基組成，可引導(dǎo)蛋白跨膜或分泌到胞外。信號肽大多位于新生肽鏈的N端，偶爾也有位于新生肽鏈的中部。不同蛋白質(zhì)的信號肽序列各不相同，但它們的結(jié)構(gòu)域可分為親水區(qū)、疏水區(qū)、加工區(qū)。親水區(qū)一般位于新生肽鏈中富含堿性氨基酸的N端。它提供正電荷，可與信號識別顆粒中帶負電的酸性氨基酸殘基形成靜電相互作用，帶電荷區(qū)域還在新生肽段轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[18]。疏水區(qū)一般為8～12個疏水性氨基酸殘基組成的α螺旋結(jié)構(gòu)[19]，也是SRP和新生肽鏈相互識別和結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。酵母SRP有 SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68、SRP72等亞基和一個7S RNA。SRP54亞基的C段(M結(jié)構(gòu)域)和疏水區(qū)結(jié)合[20]。加工區(qū)是C末端一段富含負電荷、小分子氨基酸殘基的氨基酸鏈，也是信號肽酶切割的部位[21]。在新生肽鏈中，除N端有信號肽外，C端部分肽段也對肽鏈穿越粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜起作用。例如C端肽段能終止肽鏈穿越，因此該部分肽段被稱為終止轉(zhuǎn)運序列，在某種意義上也是一種信號肽[7]。迄今為止，在畢赤酵母中成功實現(xiàn)外源蛋白分泌表達的信號肽主要有釀酒酵母α交配因子前導(dǎo)肽(Mating factor，α-MF)、釀酒酵母蔗糖轉(zhuǎn)化酶信號肽(Sucrase2，SUC2)、畢赤酵母酸性磷酸酶信號肽(Phosphatase1，PHO1)、外源蛋白自身信號肽[22]。目前畢赤酵母分泌表達的諸多外源蛋白報道中，α-MF、SUC2、PHO1作為信號肽的分泌蛋白最高產(chǎn)量分別為 22.0 g/L 羥基腈裂解酶[4]、2.5 g/L 淀粉酶[23]、2.3 g/L 過氧化氫酶[24]。以脂肪酶自身信號肽(nSB)在畢赤酵母中分泌表達脂肪酶的產(chǎn)量為 383 U/mL[25]。α-MF分泌最高的外源蛋白產(chǎn)量可能與α-MF引導(dǎo)外源蛋白至高爾基體或小囊泡的效率，或者與蛋白質(zhì)折疊和二硫鍵形成有關(guān)[26]。

2.1.2 SRP及其受體 1980年Walter等[27]首次分離得到SRP后證實其為核糖核酸蛋白復(fù)合物。敲除SRP的組成部分不會抑制新生肽鏈的合成，但是阻礙了新生肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的組裝[28]。這說明SRP的功能為引導(dǎo)多肽至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。SRP在細菌、古菌、真核生物的細胞質(zhì)中都存在[29]。細菌SRP由1條SRP RNA(4.5S RNA)和1條多肽鏈(SRP54)組成；古菌SRP由1條SRP RNA(7S RNA)和兩條多肽鏈(SRP19和SRP54)組成；真核生物(哺乳動物和酵母)SRP都是由1條SRP RNA(7SL RNA或7S RNA)和6條分子質(zhì)量分別為9、14、19、54、68和72 kDa的多肽鏈(SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68和SRP72)組成。哺乳動物的SRP54是1條約含500個氨基酸殘基的多肽鏈。這條多肽鏈由3個結(jié)構(gòu)域組成：N端的N結(jié)構(gòu)域，含GTP結(jié)合位點的G結(jié)構(gòu)域，C端富含甲硫氨酸的M結(jié)構(gòu)域[30]。M結(jié)構(gòu)域可以形成一個疏水溝槽，通過槽底部的結(jié)構(gòu)與信號肽序列結(jié)合[31]。SRP的RNA調(diào)節(jié)SRP與核糖體以及與SR的結(jié)合，并為SRP亞基組裝充當骨架[32]。哺乳動物SR是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的二聚體，由1條α鏈(α-SR)和1條β(β-SR)鏈組成。α-SR含有N結(jié)構(gòu)域和G結(jié)構(gòu)域。α-SR的G結(jié)構(gòu)域與GTP結(jié)合，且N、G結(jié)構(gòu)域與SRP54的N、G結(jié)構(gòu)域結(jié)合。β-SR主要負責(zé)SRP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合并轉(zhuǎn)運新生肽鏈[33]。SRP與SR的N結(jié)構(gòu)域通過靜電相互作用而識別。GTP水解導(dǎo)致SRP與SR解離。目前在多種酵母菌，例如釀酒酵母[34]、粟酒裂殖酵母[35]、解脂耶氏酵母[36]中都已鑒定出SRP54。但是假絲酵母屬、多形漢遜酵母、畢赤酵母中都還沒有鑒定出SRP54[37]。

2.1.3 跨膜通道 新生肽鏈利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的疏水跨膜通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。疏水跨膜通道由Sec61復(fù)合體和轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白(Translocon associated protein，TRAP)組成[16]。Sec61復(fù)合體的3個亞基(α、β、γ)形成一個疏水通道。TRAP是一個含有4個跨膜亞基的信號肽受體蛋白。TRAP與信號肽的相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)運通道[17]。TRAP還可以與錯誤折疊的新生肽鏈結(jié)合，將錯誤折疊的新生肽鏈從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆向運輸至細胞質(zhì)中降解[38]。疏水作用在信號肽引導(dǎo)新生肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號肽和信號識別顆粒的結(jié)合，以及新生肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏水通道三個環(huán)節(jié)中都發(fā)揮重要作用[39]。信號肽疏水區(qū)有利于新生多肽的分泌。Zhang等[40]將信號肽突變?yōu)楦邮杷男蛄刑岣吡艘鹊鞍酌傅姆置诹?。信號肽序列和新生多肽之間的識別并沒有嚴格的專一性[41]，所以通過設(shè)計信號肽，增強疏水性也是一種提高新生多肽分泌效率的途徑。

2.2 翻譯后轉(zhuǎn)運(Post-translational translocation)

新生肽鏈在細胞質(zhì)中核糖體上合成完畢后，再進行跨膜轉(zhuǎn)運的方式稱為翻譯后轉(zhuǎn)運。酵母菌SRP和SR的基因突變不會造成細胞死亡，說明酵母菌還存在另外的蛋白質(zhì)分泌途徑。畢赤酵母表達外源蛋白也能以“翻譯后轉(zhuǎn)運”的方式分泌[22]。采用翻譯后轉(zhuǎn)運的方式是由于信號肽的疏水性較弱而逃脫了SRP的識別[42]。新生肽鏈翻譯后，被分子伴侶(Molecular chaperone)識別后形成一定的非折疊或松散折疊的中間構(gòu)象，再由信號肽牽引至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的疏水跨膜通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔[43]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中ATP偶聯(lián)的結(jié)合蛋白(binding protein，Bip)利用ATP水解提供的能量與新生肽鏈結(jié)合。信號肽在新生肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔過程中被信號肽酶切掉。Ssa1～Ssa4(屬于Hsp70家族)是畢赤酵母中4個高度同源的分子伴侶。其功能相當于大腸埃希菌的Dnak。Ssa的缺失導(dǎo)致新生肽鏈不能進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而在細胞質(zhì)中積累。畢赤酵母的另一種分子伴侶Ydj1(屬于Hsp40家族)相當于大腸埃希菌的Dnaj。Ydj1和Ssa的協(xié)同作用促進新生肽鏈在細胞質(zhì)中保持正確的狀態(tài)，有利于順利進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行折疊[43]。分子伴侶維持新生多肽的構(gòu)象，避免新生多肽的疏水基團相互靠近形成聚體而被降解，提高了折疊效率和跨膜轉(zhuǎn)運效率。所以過表達分子伴侶可促進蛋白質(zhì)的分泌[42]。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊與修飾

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是對多肽鏈進行折疊與修飾，如二硫鍵(Disulfide bond)的形成、糖基化(Glycosylation)、羥基化(Hydroxylation)、?；?Acylation)。這些修飾對于新生肽鏈形成正確的構(gòu)象非常關(guān)鍵。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中幫助新生肽鏈折疊的蛋白質(zhì)有兩類。一類是分子伴侶；另一類是催化新生肽鏈折疊的折疊酶。已知的折疊酶有催化異構(gòu)反應(yīng)的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase，PDI)、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)兩種[44]。而PDI不僅是糖蛋白成熟過程的折疊酶，同時也起分子伴侶的作用[42]。新生肽鏈在折疊酶的作用下與Bip和鈣聯(lián)蛋白(Calnexin/calreticulin)結(jié)合而折疊成正確構(gòu)象[42]。目前已經(jīng)證實在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中與新生肽鏈的疏水區(qū)域結(jié)合，而促進分泌效率的分子伴侶有Bip、PDI、Sec63、Ydj1、Ssa1等[21]。Li等[45]共表達Bip將皺褶假絲酵母脂肪酶提高了1.18倍。Sha等[46]通過共表達PDI將脂肪酶的產(chǎn)量提高了2.74倍。Kar2p、Ssa1p、PDI將粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)的表達量提高4～7倍。而且伴侶蛋白的組合對外源蛋白表達量的提高有協(xié)同作用，共表達YDJ1p/PDI、YDJ1p/Sec63、Kar2p/PDI 將G-CSF 的表達量分別提高8.7、7.6、6.5倍[47]。畢赤酵母對新生肽鏈的修飾還有去除起始甲硫氨酸、N-乙?；-甲基化、和豆蔻酰化等。這些修飾有利于避免外源蛋白的免疫原性，也對膜蛋白的表達有幫助[48]。

糖基化也是畢赤酵母對新生肽鏈常見的修飾方式。糖基化伴隨著多肽鏈的合成同時進行。根據(jù)糖與氨基酸殘基的連接類型分為O-糖基化和N-糖基化。O-糖基化由O-糖基化轉(zhuǎn)移酶(PMT)催化將糖連接到絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)的羥基上。PMT是一種以二聚體形式發(fā)揮作用的跨膜蛋白。畢赤酵母有5個pmt基因。PMT利用磷酸醇介導(dǎo)將1個甘露糖轉(zhuǎn)移到蘇氨酸、絲氨酸等殘基上。甘露糖轉(zhuǎn)移酶進一步在甘露糖上增加4個以上的甘露糖分子，最終形成Man-α、1-2(1-4)-Ser/Thr型的O-糖鏈[49]。但是目前還無法準確預(yù)測O-糖基化的位點。N-糖基化是將糖鏈連接到新生肽鏈的天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸(Asn-X-Ser/Thr，X為除脯氨酸以外的任何一種氨基酸)三聯(lián)體的天冬酰胺上。N-糖基化過程首先是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖與磷酸多萜醇形成一個脂多糖前體(Glu3Man9GluNAc2)。然后，N-糖基轉(zhuǎn)移酶將該前體的多糖鏈部分轉(zhuǎn)運至新生肽鏈中Asn-X-Ser/Thr三聯(lián)體的Asn殘基上。隨后新生肽鏈經(jīng)過葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ切除多糖鏈的3個葡萄糖殘基，并且經(jīng)過甘露糖苷酶Ⅰ切除1個甘露糖后，形成GluMan8NAc2結(jié)構(gòu)[50]。這兩種糖基化修飾步驟和新生肽鏈招募分子伴侶和折疊酶同步進行得到折疊與修飾后的糖蛋白。最后，糖蛋白以囊泡形式轉(zhuǎn)運到高爾基體。進而，在α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(OCH)和α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(MNN)的作用下添加α-1，6-甘露糖和α-1，3-甘露糖。其他的甘露糖轉(zhuǎn)移酶和磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶繼續(xù)特異地識別此糖鏈，并添加甘露糖和磷酸甘露糖，形成高甘露糖結(jié)構(gòu)[51]。釀酒酵母的寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(Oligosaccharyltransferase complex，OST)包括Ost1p、Ost2p、Ost3p、Ost4p、Ost5p、Ost6p、Stt3p、Swp1p、Wbp1p共 9個亞基，催化N-糖基化反應(yīng)。其中Ost3p、Ost4p和Stt3p形成的復(fù)合物直接參與靶肽識別。畢赤酵母的Stt3p與釀酒酵母Stt3p有65%的同源性[52]。

與釀酒酵母相比，畢赤酵母表達外源蛋白的糖基化程度有所減輕，但與天然蛋白質(zhì)相比，仍然存在著過度糖基化的問題。過度糖基化會使蛋白產(chǎn)物相對分子質(zhì)量不均一，蛋白質(zhì)的功能位點被掩蓋。因此對畢赤酵母糖基化過程改造非常必要。目前畢赤酵母糖基化改造方法有通過抑制OCH1酶活性消除內(nèi)源性高甘露糖；引入α-1，2-糖苷甘露糖苷酶Ⅰ降解高甘露糖；引入類似于哺乳動物的唾液酸化復(fù)雜聚糖成分[53]。

新生肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進行折疊和修飾后應(yīng)該進入高爾基體進行再加工。外源蛋白過量表達會占用大量的分子伴侶等輔助因子。在葡萄糖饑餓等脅迫條件下，有的新生肽鏈會因為缺乏分子伴侶而無法正確折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)會積累大量未折疊和折疊錯誤的蛋白質(zhì)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(Endoplasmic reticulum stress，ERS)。這些未折疊或錯誤折疊會被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中繼續(xù)折疊或被運轉(zhuǎn)到細胞質(zhì)中降解[54]。細胞主要通過未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)[55]和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(Endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)途徑[56]來調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)長時間保持ERS狀態(tài)，細胞會啟動凋亡程序。

UPR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下激活的主要信號通路之一，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)上調(diào)分子伴侶和折疊酶的表達量來提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有3種跨膜蛋白可以感知未正確折疊新生肽鏈，分別為Ire1p、Hac1p、Rlg1p。當大量未正確折疊新生肽鏈存在時，Ire1上的Bip/Kar2解離后暴露了Ire1的二聚體結(jié)合位點，Ire1形成二聚體而導(dǎo)致自身磷酸化[57]。磷酸化后的Ire1二聚體能特異地剪切細胞質(zhì)中的hac1 mRNA(hac1u)內(nèi)含子。剪切后的hac1 mRNA(hac1i)由Rlg1p連接后翻譯成具有活性的轉(zhuǎn)錄因子Hac1。Hac1結(jié)合染色體的UPR元件上調(diào)UPR相關(guān)基因。這些UPR相關(guān)基因主要編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶和折疊酶類，如Bip/Kar2、二硫鍵異構(gòu)酶PDI和凝集素類蛋白CNX/CRT等[58]。

ERAD是廣泛存在于酵母和哺乳動物的降解未正確折疊新生肽鏈的途徑。當未正確折疊新生肽鏈與Hsp70長時間結(jié)合就會被E3泛素連接酶Hrd1復(fù)合物識別。新生肽鏈糖基化錯誤而帶有Man7GlcNAc2糖鏈時，會被凝集素類蛋白Yos9的腔結(jié)構(gòu)域識別。被識別的新生肽鏈在E泛素激活酶(Uba1)、E2泛素結(jié)合酶(Ubc6/Ubc7)、E3泛素連接酶(Hrd1/Doa10)的作用下將泛素結(jié)合到新生肽鏈中賴氨酸殘基的ε氨基上。經(jīng)泛素化的新生肽鏈在Usa1、Ubx2和Cdc48等因子作用下逆向運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，被細胞質(zhì)中蛋白酶體降解，然后用于合成新的蛋白質(zhì)[58]。

4 高爾基體加工和運輸

高爾基體主要對新生肽鏈進行分類轉(zhuǎn)運、糖鏈改造。帶寡糖鏈的新生肽鏈還需要在高爾基體中加工才能成為有活性的外源蛋白。細胞中大量的高爾基堆成具有多個扁平囊泡后，以囊泡穿梭和囊泡成熟2種方式轉(zhuǎn)運外源蛋白。囊泡穿梭是基于扁平囊泡內(nèi)存在一套特殊的蛋白加工系統(tǒng)。外源蛋白在囊泡中沿著高爾基堆穿梭而成為有活性的外源蛋白。囊泡成熟方式認為囊泡沿著高爾基由順面向反面移動，再將外源蛋白從反面扁平囊泡運回[59-60]。高爾基體通過出芽的方式形成小泡將外源蛋白運輸?shù)郊毎じ浇?，然后與質(zhì)膜融合使分泌小泡內(nèi)的外源蛋白釋放到胞外。

外源蛋白分泌有被膜小泡COPⅠ(Coat protein complex I)、被膜小泡COPⅡ (Coat protein complex II)和網(wǎng)格蛋白(Calthrin)介導(dǎo)3種方式。COPⅠ的作用為介導(dǎo)外源蛋白從高爾基體反面分泌到順面，介導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順行轉(zhuǎn)運，以及從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向運輸，將逃逸蛋白回收到正確位置[61]。被膜小泡COPII是由5個高度保守蛋白(小G 蛋白Sar1、內(nèi)衣被蛋白Sec23和Sec24、外衣被蛋白Sec13和Sec31)組成的基本單位形成[62]。COPII小泡主要介導(dǎo)蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向運輸。網(wǎng)格蛋白產(chǎn)生于高爾基體，介導(dǎo)外源蛋白從高爾基體到細胞膜的運輸。這三種小泡都需要GTP結(jié)合蛋白(Sar與ARF)的協(xié)助才能完成運輸。小泡到細胞膜的過程借助于細胞骨架完成蛋白識別、裝配、去裝配等步驟的調(diào)控[63]。小泡與質(zhì)膜的融合主要由SNARE蛋白(Soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)介導(dǎo)。小泡上的v-SNARE蛋白識別質(zhì)膜上的t-SNARE后，形成SNARE復(fù)合體，達到定位的作用。最后，小泡和質(zhì)膜融合將外源蛋白釋放到胞外[64]。

5 展 望

改造畢赤酵母的外源蛋白分泌途徑是研究熱點。隨著畢赤酵母基因組序列的公布，從整體視角考慮各種限制因素，有利于對外源蛋白分泌的分子機制研究[65]。目前已有改造分泌途徑的蛋白而提高外源蛋白的產(chǎn)量的研究成果。例如共表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白Hac1p分別提高白介素-10和唾液酸酶達2.2倍和2.1倍[66]。Vanz等[67]優(yōu)化培養(yǎng)過程降低UPR和ERAD途徑的相關(guān)蛋白，將胰島素原的表達量大幅度提高。Wang等[68]優(yōu)化氮源流加降低UPR和ERAD途徑相關(guān)蛋白使肽鏈內(nèi)切酶的表達量提高1.48倍。本文總結(jié)畢赤酵母外源蛋白分泌途徑中涉及的基因和蛋白，介紹了其功能，為進一步調(diào)控外源蛋白分泌提供基礎(chǔ)。在畢赤酵母的5 000多個基因中，已知可能參與外源蛋白分泌的約有400多個，但仍然難以達到對蛋白分泌的控制[42]，因此需要進一步挖掘影響外源蛋白分泌的關(guān)鍵基因和蛋白。例如，畢赤酵母中仍有很多基因還沒鑒定，所以鑒定畢赤酵母基因，表征其蛋白的功能是完善蛋白分泌途徑不可或缺的工作。而且，外源蛋白的分泌是一個動態(tài)的生物化學(xué)過程。其中影響基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的各種因素相互作用，形成調(diào)控蛋白表達的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)，也是調(diào)控外源蛋白分泌的難點。畢赤酵母表達外源蛋白的機制為底物依賴性，培養(yǎng)條件的變化也會引起畢赤酵母代謝途徑的改變。這些改變也涉及到基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的變化。所以進一步闡明畢赤酵母的外源蛋白分泌途徑和機制還有很多工作需要開展。