鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的構(gòu)建策略

陳奕公，徐春燕，岳思君，李雅楠，蘇建宇

(寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

來源于鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物在醫(yī)學、畜牧獸醫(yī)、植物保護等領(lǐng)域具有重要的應用價值[1]。由于部分鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物難以實現(xiàn)高通量篩選，且絕大多數(shù)新發(fā)現(xiàn)的次級代謝產(chǎn)物基因簇在常規(guī)發(fā)酵中不表達或者表達量極小，因此，需要對野生鏈霉菌菌株進行改造，使其高效表達這些次級代謝產(chǎn)物基因簇，從而支撐相應次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[2-3]。傳統(tǒng)的物理化學誘變通過單一或復合的誘變篩選，得到次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)突變菌株，但長期重復使用某種誘變方式會導致菌株抗性飽和、突變率降低以及突變譜變窄。隨著全基因組測序技術(shù)的普及，通過對比分析野生菌株和正向突變菌株的基因組序列，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學以及酶學研究，使得在基因組水平上研究自發(fā)突變和誘導突變的過程以及基因突變與產(chǎn)量性狀之間的關(guān)系成為可能，從而有助于通過代謝工程手段進一步提高菌株次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。本文綜述了近年來鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株構(gòu)建的相關(guān)研究進展。

1 基因表達調(diào)控提高產(chǎn)量

細胞代謝調(diào)控網(wǎng)絡決定著鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物基因的表達。對于次級代謝產(chǎn)物基因表達的調(diào)控，目前常采用啟動子優(yōu)化選擇、正調(diào)控基因過表達、負調(diào)控基因阻斷抑制、轉(zhuǎn)錄及翻譯元件修飾、轉(zhuǎn)運蛋白翻譯后磷酸泛酰巰基乙胺羥基化等策略，提高細胞次級代謝產(chǎn)物的表達量。

1.1 啟動子優(yōu)化選擇

強啟動子可有效提高目的基因的表達量，因此被廣泛應用于次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。ermEp*是鏈霉菌中使用最為普遍的組成型強啟動子，此外，誘導型強啟動子tcp830[4]、PA3[5]、tipAp、nitAp[6]、actIp、TREp[7]等也廣泛應用于鏈霉菌代謝工程和合成生物學改造。針對不同的鏈霉菌宿主采用不同啟動子，目的基因的表達效果可能會存在差異，因此需要在工程菌株構(gòu)建時對啟動子進行優(yōu)化選擇。李佳等[8]將加納鏈霉菌(S.ghanaensis)phage I19中的多重強啟動子Psf與ermEp*通過卡那霉素抗性梯度及鄰苯二酚2，3-雙加氧酶顯色系統(tǒng)進行比較，發(fā)現(xiàn)在大部分鏈霉菌中Psf與ermEp*均可使目的基因高效表達，但棒狀鏈霉菌(S.clavuligerus)以及S.coelicolor中Psf的表達活性要高于ermEp*。楊克遷課題組將Kasop*與鏈霉菌中已有的強啟動子ermEp*和SF14p在S.coelicolor中進行對比，發(fā)現(xiàn)Kasop*具有最高的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平活性[9]。該課題組對S.coelicolor中不同時序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析和實驗驗證，獲得了116個不同強度的組成型啟動子，為鏈霉菌合成生物學研究提供了有力的元件支持[10]。

1.2 基因的正、負調(diào)控表達

過表達正調(diào)控基因可在很多次級代謝產(chǎn)物的合成中發(fā)揮促進作用。弗氏鏈霉菌(S.fradiae)泰樂菌素的生物合成受多個正、負調(diào)控因子調(diào)控[11-12]。將正調(diào)控基因tylR插入弗氏鏈霉菌基因組φC31attB位點，使其在胞內(nèi)形成雙拷貝，在組成型強啟動子ermEp*轉(zhuǎn)錄控制下，可使Lilly公司S.fradiaeC4菌株的泰樂菌素產(chǎn)量提高50%[13]。同樣是16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，螺旋霉素的生物合成中的關(guān)鍵基因SrmR(Srm22)受到Srm40的正調(diào)控[14-15]，在ermEp*轉(zhuǎn)錄調(diào)控下導入含srm40的多拷貝質(zhì)粒，可以使螺旋霉素的效價提升近4倍。

敲除或抑制負調(diào)控基因，也是顯著提高鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑之一。野生型鏈霉菌S.rapamycinicus的雷帕霉素產(chǎn)量低于10 mg/L。雷帕霉素合成受5個調(diào)控基因的影響[16]，其中負調(diào)控基因rapY、rapR、rapS分別編碼TetR家族阻遏蛋白雙組分應答調(diào)控因子、應答因子以及組氨酸激酶，過表達任何一個負調(diào)控基因都會導致雷帕霉素產(chǎn)量的下降，而敲除rapS或rapY都會使雷帕霉素效價提高。Yoo等[17]通過敲除rapS基因，并在ermEp*轉(zhuǎn)錄控制下雙拷貝過表達能抑制rapY表達的rapX，最終S.rapamycinicus的雷帕霉素的產(chǎn)量達到49 mg/L，較出發(fā)菌株提高6.7倍。而單獨組成型表達rapX能使雷帕霉素產(chǎn)量提高3.5倍。Wu等[18]發(fā)現(xiàn)TetR家族負調(diào)控基因SACE_3986對紅色糖多孢菌(S.erythraea)紅霉素生物合成具有負調(diào)控作用，敲除SACE_3986后，S.erythraea的紅霉素產(chǎn)量可增加54%。阻斷負調(diào)控基因同樣可以提高核苷類抗生素的產(chǎn)量，在Muraymycin生產(chǎn)菌珠Streptomycessp.NRRL30471中，阻斷其基因簇中的負調(diào)控基因mur34，可以將Muraymycin C1和D1產(chǎn)量提高10倍[19]。

1.3 轉(zhuǎn)錄與翻譯元件的修飾

研究表明，鏈霉菌利福平抗性突變株中編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因發(fā)生點突變，其結(jié)果使變鉛青鏈霉菌(S.lividans)的十二烷基靈菌紅素、放線紫紅素和鈣依賴性抗生素產(chǎn)量均有所提高[12]，同樣的現(xiàn)象也存在于S.erythraea合成紅霉素、灰色鏈霉菌(S.griseus)合成鏈霉素、抗菌素鏈霉菌(S.antibioticus)合成放射霉素、白色鏈霉菌(S.albus)合成鹽霉素[20]。除rpoB外，RNA聚合酶主要的σ亞基(HrdB或σHrdB)已被確定為提高阿維鏈霉菌(S.avermitilis)阿維菌素產(chǎn)量的有效作用靶點[21-22]。

研究發(fā)現(xiàn)，阻斷編碼30S核糖體亞基裝配輔助因子的rimP基因，可提升S.coelicolor的放線紫紅素以及鈣依賴性抗生素的產(chǎn)量[23]，也會提高異源表達的華光霉素和多氧霉素合成基因的水平。rimP突變體生長較親代緩慢，但有著更高的轉(zhuǎn)錄和翻譯保真度，會提升5種全局調(diào)控基因absR1、adpA、afsR、atrA和rnc的轉(zhuǎn)錄，減少3種負調(diào)控因子phoP、ndgR和ssgA的轉(zhuǎn)錄，提升metK(編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶)以及放線紫紅素和鈣依賴性抗生素合成代謝通路上的特異性激活因子ActII-ORF4和CdaR的翻譯水平。而過表達編碼核糖體循環(huán)因子的frr基因，可使S.coelicolor的放線紫紅素產(chǎn)量及S.avermitilis的阿維菌素產(chǎn)量得到提高[12]。

鏈霉菌在穩(wěn)定期合成蛋白的能力是啟動次級代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵。S.coelicolor合成放線紫紅素過程中，特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白ActII-ORF4的濃度決定著同源合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄效率[24]。Wang等[25]通過向S.coelicolor中引入多重抗生素抗性基因(str、gen、rif、par、gnt、fus、tsp、lin)，篩選到能同時耐受7～8種抗生素的突變菌株C7、C8，其突變核糖體有異常的蛋白和ppGpp合成活性，結(jié)果使放線紫紅素的產(chǎn)量較野生型提高180倍。大量同類研究表明對核糖體進行修飾改造是提升次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的有效途徑之一。

1.4 載體蛋白翻譯后的修飾

I型和II型聚酮合酶(PKS)與非核糖體肽合成酶(NRPS)中，酰基載體蛋白(ACP)、肽酰載體蛋白(PCP)及巰基化區(qū)域需經(jīng)磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTases)修飾連接磷酸泛酰巰基乙胺基團使其發(fā)揮生物活性[26]。在鏈霉菌中，有AcpS型和Sfp型兩種PPTases[27]，是控制合成聚酮的限速酶。

Fernández-Martínez等[28]確定了S.venezuelae中一個編碼與氯霉素生物合成有關(guān)的Sfp型PPTase基因cmlL，通過在S.coelicolorM1152中表達cmlL，使得氯霉素產(chǎn)量達到50 mg/L，當敲除該PPTase基因后，氯霉素產(chǎn)量只有20 mg/L。Hui等[29]發(fā)現(xiàn)在聚烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素游霉素生產(chǎn)菌株S.chattanoogensisL10中，有兩種PPTases(Sfp型SchPPT和AcpS型SchACPS)，其中SchPPT可以激活I(lǐng)型及II型聚酮合酶的?；d體蛋白，SchACPS可以激活I(lǐng)I型聚酮合酶和脂肪酸合成酶的?；d體蛋白。阻斷SchPPT基因會導致游霉素合成受阻，而過表達SchPPT的重組子，游霉素產(chǎn)量較親本菌株可提高40%。

2 轉(zhuǎn)座子突變提高產(chǎn)量

轉(zhuǎn)座子可在鏈霉菌中用來阻斷、比對次級代謝產(chǎn)物生物合成基因，通過插入基因片段來提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。轉(zhuǎn)座子還可用來鑒定鏈霉菌染色體中的中性插入位點[30-31]。

鏈霉菌中導入自我復制的質(zhì)粒后會明顯影響次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。將編碼泰樂菌素生物合成關(guān)鍵酶——大菌素甲基轉(zhuǎn)移酶的tylF基因插入自我拷貝質(zhì)粒pIJ702中，導入泰樂菌素生產(chǎn)菌S.fradiae內(nèi)，會導致泰樂菌素前體物質(zhì)合成量及泰樂菌素產(chǎn)量顯著降低。通過pKC796質(zhì)粒將tylF插入φC31attB位點并整合至染色體，導致S.fradiae所有大環(huán)內(nèi)酯產(chǎn)量降低[32]。解決這一問題的有效辦法就是把基因插入到染色體的中性位點內(nèi)?？梢圆扇〉牟呗裕孩賹⒛康幕虿迦朕D(zhuǎn)座子中并導入染色體內(nèi)，再篩選中性位點插入基因的重組子；②首先通過轉(zhuǎn)座子突變鑒定宿主菌染色體中性位點，再通過同源重組向轉(zhuǎn)座子序列插入目的基因；③克隆染色體中性位點，插入目的基因，再通過同源重組整合進中性位點。Solenberg等[33]對Lilly公司泰樂菌素生產(chǎn)菌株S.fradiaeC373.17進行中性位點分析，結(jié)果表明其染色體中有約50%的插入位點為中性，其他位點則會導致泰樂菌素發(fā)酵效價降低，揭示了S.fradiae編碼的大約3 000個基因并不是高產(chǎn)泰樂菌素所必須的。通過轉(zhuǎn)座子Tn5099互換，該課題組將tylF的第二個拷貝插入S.fradiaeC373.17染色體的中性位點上，可將泰樂菌素的發(fā)酵產(chǎn)量提高30%。

3 合成生物學方法提高產(chǎn)量

借助基因組挖掘技術(shù)，已有越來越多的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇被人們所了解。通過對次級代謝產(chǎn)物合成基因(簇)的復制及擴增、刪除或阻斷次級代謝產(chǎn)物的競爭通路、重構(gòu)未知次級代謝產(chǎn)物基因簇及其異源表達、次級代謝產(chǎn)物高效表達體系構(gòu)建等合成生物學手段在提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

3.1 次級代謝產(chǎn)物合成基因的復制及擴增

獨立基因或完整的次級代謝產(chǎn)物基因簇的復制及高度擴增是提高次級代謝產(chǎn)物效價的有效方法[12]。針對次級代謝產(chǎn)物合成前體的供給等問題，在插入解除限速的基因后，原次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌也可充當宿主，借助誘變、重組和其他靶向分子遺傳途徑來進一步提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

細菌人工染色體(BAC)和由P1噬菌體衍生的人工染色體(PAC)載體中，可以克隆很大的鏈霉菌DNA片段[34]，因而可以插入次級代謝產(chǎn)物基因簇或外源功能基因片段，實現(xiàn)增加目的基因拷貝數(shù)或增加次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的目的[35]。Yanai等[36]以卡那霉素生產(chǎn)株系為出發(fā)菌株，通過增加卡那霉素基因簇拷貝數(shù)，篩選到卡那霉素高產(chǎn)菌株卡那霉素鏈霉菌(S.kanamyceticus)12-6，其卡那霉素產(chǎn)量可達到376 mg/L，是親本產(chǎn)量水平的2倍。Murakami等[37]構(gòu)建了ZouA介導的DNA擴增系統(tǒng)[38]，使S.coelicolor放線紫紅素產(chǎn)量達到450 mg/L，高于對照水平20倍。Zhou等[39]在吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)5008中應用了這個系統(tǒng)擴增井岡霉素A的基因簇，將井岡霉素的基因簇進行多拷貝串聯(lián)，使井岡霉素A產(chǎn)量由15 g/L提高至21 g/L(圖1)。

圖1 ZouA介導的DNA擴增系統(tǒng)在不同宿主內(nèi)的應用Fig.1 Application of ZouA mediated DNA amplification system in different hostsKan：卡那霉素；Act：放線紫紅素；Val：井岡霉素Kan：Kanamycin；Act：Actinomycin；Val：Jinggangmycin

3.2 刪除或阻斷次級代謝產(chǎn)物的競爭通路

鏈霉菌合成的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物在胞內(nèi)過量積累會影響其自身生長或?qū)ζ浜铣赏緩疆a(chǎn)生反饋抑制，從而限制產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。此外，次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵中，副產(chǎn)物的積累也會影響目的產(chǎn)物的合成及產(chǎn)品純度，限制了目的產(chǎn)物的發(fā)酵水平與實際應用。刪除或阻斷次級代謝產(chǎn)物的競爭通路可有效解決這一問題。

在尼莫克汀發(fā)酵生產(chǎn)中，LL-F28249λ(該組分難以去除)、LL-F28249γ和LL-F28249ω三種副產(chǎn)物的生成影響了尼莫克汀的產(chǎn)量和產(chǎn)品純化。研究發(fā)現(xiàn)，尼莫克汀生物合成基因簇中，nemD失活可導致C5-OH基團不能被進一步甲基化，從而阻斷LL-F28249λ和LL-F28249γ的合成。黨福軍等[40]通過構(gòu)建和篩選藍灰鏈霉菌(S.cyaneogriseus)基因組文庫，獲得與LL-F28249ω合成相關(guān)基因nolB，采用連續(xù)敲除的方法定向改造尼莫克汀生產(chǎn)菌株，獲得敲除nemD和nolB的分子改造菌株，不僅使尼莫克汀發(fā)酵水平提高27.4%，且發(fā)酵產(chǎn)物中不再含有上述三種雜質(zhì)成分。肖劍萍等[41]通過敲除黑暗鏈霉菌(S.tenebrarius)Tt-49中磷酸變位酶基因aprJ，阻斷了安普霉素合成，使菌體代謝流轉(zhuǎn)向合成氨甲酰妥布霉素。在此基礎(chǔ)上，再進一步敲除氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶基因tobZ，使妥布霉素無法正常氨甲酰化，從而構(gòu)建了大量積累妥布霉素、不再合成安普霉素和氨甲酰妥布霉素的工程菌株。

3.3 重構(gòu)未知次級代謝產(chǎn)物基因簇及其異源表達

基因組測序和分析技術(shù)的進步，使得鏈霉菌中大量與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的隱性基因簇被逐漸發(fā)現(xiàn)。為了激活細胞內(nèi)隱性基因簇，常用的方法是將某個基因簇完整地轉(zhuǎn)入另一宿主進行表達，或者采用各種極端條件刺激菌體以啟動其隱性基因簇的表達。這些方法操作繁瑣，且大量試驗后未必能獲得理想的效果。

Luo等[42]采用DNA assembler技術(shù)，將啟動子插入一個隱性基因簇中單個基因之間，來協(xié)助調(diào)控鄰近基因表達的數(shù)量和時機，使基因簇中的每個基因均能被持續(xù)激活，進而改編細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控。他們將6個啟動子插入S.griseus中的隱性基因簇(包含6個基因)中并導入異源宿主S.lividans內(nèi)進行表達，重構(gòu)的菌株合成了一些大環(huán)內(nèi)酰胺代謝產(chǎn)物(PTM)，很多具有生物醫(yī)學應用的潛力。在進一步的研究工作中，該課題組[43]通過對S.albusJ1074進行RNA序列分析，從篩選得到的32個強啟動子中選取5個強度最高的啟動子，引入S.griseus基因組擴增出的PTM基因簇開放閱讀框內(nèi)進行重構(gòu)，并分別在S.lividans66、S.albusJ1074和S.coelicolorM1146中成功表達，PTM的效價相較于對照得到了明顯提升。

3.4 高效表達底盤的構(gòu)建

鏈霉菌屬的微生物是很多天然活性產(chǎn)物的合成載體，可充當宿主并借助同源的合成通路來表達相應的次級代謝產(chǎn)物基因簇。應用于基因組挖掘技術(shù)及次級代謝產(chǎn)物生物合成的鏈霉菌表達宿主需要在不影響自身生長和目標產(chǎn)物合成的前提下，去除一些非必須次級代謝產(chǎn)物基因簇，將基因組簡化或刪除部分競爭途徑[44]。利用同源重組方法敲除基因需要消耗大量時間，Zhou等[45]耗時多年通過連續(xù)敲除，構(gòu)建了一個去除900 kb端粒序列(占全基因組的14%)以及全部10個PKS、NRPS基因簇的S.coelicolor菌株，并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了放線紫紅素的過表達。

φBT1整合酶能在體外高效催化attB和attP之間的重組反應，快速構(gòu)建基因打靶載體，完成靶標基因的替換。Zhang等[46]運用此方法在阻斷S.coelicolorM145中鈣依賴性抗生素以及放線紫紅素合成通路的基礎(chǔ)上，敲除十二烷基靈菌紅素合成負調(diào)控基因rrdA，從而得到比野生型十二烷基靈菌紅素產(chǎn)量高5倍以上的突變株ZB8。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為多個不同基因組的編輯以及改造表達體系提供了新的途徑。CRISPR/Cas9技術(shù)可在鏈霉菌中高效刪除基因或基因簇，實現(xiàn)基因的精確替換，并能可逆地控制靶基因的表達[47]。

Cobb等[48]將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用于鏈霉菌多基因快速編輯，在S.lividans、S.albus、綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridochromogenes)中能夠刪除單個或兩個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇片段(20～30 kb)，刪除效率高達70%～100%。他們運用pCRISPomyces系統(tǒng)在S.lividans中高效刪除了十二烷基靈菌紅素完整合成途徑的基因簇(31.4 kb)，在S.albusJ1074中刪除了聚酮合酶-非核糖體肽合成酶(PKS-NRPS)雜合基因簇(13.2 kb)，從而切斷了該代謝通路。

Huang等[49]建立了用于鏈霉菌基因操控的高效CRISPR/Cas9基因組編輯質(zhì)粒pKCcas9dO，包括一個靶向特異性向?qū)NA、密碼子優(yōu)化的cas9以及兩個同源介導的雙鏈DNA修復(HDR)模板(圖2)。通過一步接合轉(zhuǎn)移，將pKCcas9dO系列編輯質(zhì)粒導入模式菌S.coelicolorM145中，獲得不同編輯水平的基因組，包括actll-orf4、redD和glnR單基因的缺失，放線紫紅素(21.3 kb)、十二烷基靈菌紅素(31.6 kb)以及鈣依賴性抗生素(82.8 kb)獨立次級代謝產(chǎn)物基因簇的缺失，編輯效率可達60%～100%。

圖2 CRISPR/Cas9基因編輯質(zhì)粒pKCcas9dO的編輯策略Fig.2 Editing strategy of CRISPR/Cas9 gene editing plasmid pKCcas9dO

4 組學方法的綜合應用

Robles-Relglero等[50]通過對S.clavuligerus全霉素高產(chǎn)突變株進行蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)突變株中HlmD、HlmF以及HlmG相對野生菌株呈現(xiàn)表達差異，通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜測定其末端蛋白序列以及在高產(chǎn)株中對hlmH、hlmE、hlmM、hlmI進行失活試驗，定位了S.clavuligerus全霉素生物合成基因簇，并在S.albus中異源表達了全霉素，說明基因簇中與全霉素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因是完整的[51]。Lum等[52]比較分析了紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraea的野生型和高產(chǎn)菌株，發(fā)現(xiàn)紅霉素合成基因簇中沒有相關(guān)的調(diào)控基因，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明紅霉素合成基因持續(xù)協(xié)同表達可能是受一個全局調(diào)控機制的影響。為了找出可能的全局調(diào)控蛋白，Chng等[53]進行DNA結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)BldD蛋白關(guān)聯(lián)著紅霉素合成基因簇內(nèi)的所有5個啟動子區(qū)域。相較于野生型，紅霉素生產(chǎn)菌株中bldD表達水平更高，當敲除bldD后，會影響紅霉素生產(chǎn)菌在固體培養(yǎng)基中的生長分化，并導致紅霉素產(chǎn)量降低7倍。Kirm等[54]通過比較蛋白質(zhì)組學對S.erythraea的野生型和生產(chǎn)菌株進行分析，尋找生產(chǎn)菌中的高表達調(diào)控基因。他們發(fā)現(xiàn)編碼調(diào)控蛋白SACE_5599的基因與林可鏈霉菌(S.lincolnensis)中林可霉素合成途徑中的lmbU基因以及類球形鏈霉菌(S.spheroides)中新生霉素基因簇內(nèi)的novE正調(diào)控基因相關(guān)。轉(zhuǎn)錄研究表明紅霉素生產(chǎn)菌株中SACE_5599表達量是野生型的20倍。在野生型菌株中雙拷貝組成型表達SACE_5599可提升紅霉素產(chǎn)量，在生產(chǎn)菌株中則沒有提升，但在生產(chǎn)菌株中敲除SACE_5599會導致產(chǎn)孢缺陷，紅霉素效價下降。SACE_5599以及bldD的過表達，可提升菌體紅霉素的合成和產(chǎn)孢能力，同時也表明這兩個基因是緊密關(guān)聯(lián)的。

5 展 望

鏈霉菌基因組內(nèi)含有大量的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，能編碼豐富的次級代謝產(chǎn)物，是抗生素等生物活性物質(zhì)篩選的重要來源。然而，許多鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物合成基因簇處于沉默狀態(tài)，實驗條件下并不表達合成相應產(chǎn)物，或表達量很低，傳統(tǒng)的篩選方法很難獲得新的有價值的次級代謝產(chǎn)物。隨著全基因組測序和分析技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的鏈霉菌隱性次級代謝產(chǎn)物合成基因簇被發(fā)現(xiàn)，這些隱性基因簇所編碼的產(chǎn)物大多數(shù)是未被鑒定的化合物。深入研究這些新發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物，對于推動新型治療藥物的開發(fā)具有重要意義。因此，必須建立使鏈霉菌大量表達這些產(chǎn)物的技術(shù)方法。

利用基因工程技術(shù)，對鏈霉菌隱性次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的表達及產(chǎn)物合成代謝調(diào)控等方面進行系統(tǒng)研究，在此基礎(chǔ)上，采取合理的構(gòu)建策略對鏈霉菌菌株進行分子改造，激活其中的隱性基因簇或?qū)﹄[性基因簇進行異源表達，使次級代謝產(chǎn)物的合成量顯著提高，將為新型治療藥物的發(fā)現(xiàn)和研究奠定重要的基礎(chǔ)。這方面的研究將是今后鏈霉菌生物活性物質(zhì)研究領(lǐng)域的重要工作。