運用實時熒光定量PCR法研究榨菜腌制過程中細菌和真菌數(shù)量變化

李鳳珠，張玉禮，楊吉霞*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,400715) 2(重慶市涪陵榨菜集團股份有限公司，重慶,408000) 3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(重慶)，重慶,400715)

涪陵榨菜采用莖瘤芥(Brassicajuncea)(俗稱青菜頭)腌制加工，是世界三大名腌菜之一[1-2]。榨菜加工工藝包括3次腌制和3次壓榨：第1次腌制采用菜塊質(zhì)量2%～4%的食鹽腌制約7 d，第2次加入4%～8%質(zhì)量分數(shù)的食鹽腌制20～30 d，第3次加入質(zhì)量分數(shù)為10%左右的食鹽腌制4～6個月，每次腌制結(jié)束時都將榨菜起池、壓榨去水[3]。

青菜頭屬于膨大莖，粗壯肥碩，生食有苦辣味，口感不佳，經(jīng)過腌制成為異常鮮美脆嫩的榨菜。榨菜腌制過程中有明顯的產(chǎn)酸產(chǎn)氣等發(fā)酵現(xiàn)象，因此學(xué)者們推測微生物對于榨菜風(fēng)味品質(zhì)的形成發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-6]。楊珺等[7]、賈巍[8]采用了培養(yǎng)法，鑒定出數(shù)十種微生物，細菌主要有：明串珠菌、乳桿菌、片球菌、魏斯氏菌等，酵母菌主要有魯氏酵母、漢遜氏酵母等，霉菌主要有青霉和曲霉。榨菜微生物數(shù)量相關(guān)的研究主要集中于第3次腌制時期[7-8]，即后熟階段，因為這一階段是風(fēng)味品質(zhì)形成的關(guān)鍵時期，例如根據(jù)賈巍[8]的研究，細菌、酵母初始(第1天)數(shù)量分別為2.7×103、2.1×102個/g，第60天均增加到105個/g，第120天分別降到104、103個/g，第180天均降至103個/g；霉菌初始數(shù)量為4.25×103個/g，在整個后熟階段保持于103個/g但數(shù)量一直下降。目前很少有文獻分析第1、2次腌制時期微生物數(shù)量，缺少對整個腌制過程中微生物數(shù)量變化完整的描述。另一方面，培養(yǎng)法存在一定的局限性，不能檢出不可培養(yǎng)的微生物，榨菜腌制3個階段NaCl的質(zhì)量濃度不同，而培養(yǎng)法中采用相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，不一定適合所有微生物的生長[9-10]。更加深入地研究榨菜整個腌制過程中微生物數(shù)量變化過程，可以為榨菜腌制工藝改進、提高過程控制水平提供重要的參考數(shù)據(jù)。

近年來，實時熒光定量技術(shù)(quantitative real-time PCR，qPCR)已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境樣品中微生物的數(shù)量分析[11]，提取樣品的宏基因組DNA，采用細菌或者真菌的特異性引物做qPCR擴增，根據(jù)標準曲線定量即可檢測出樣品中細菌、真菌的數(shù)量[12]。qPCR為免培養(yǎng)方法，反映樣品中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的所有細菌或者真菌的數(shù)量。qPCR技術(shù)主要采用2種方法構(gòu)建標準曲線：第1種方法是將標準菌株液體培養(yǎng)物做10倍梯度稀釋，提取基因組DNA作為模板進行qPCR擴增，用Ct值和菌液濃度構(gòu)建標準曲線[13]，這種方法容易受到標準菌株培養(yǎng)性質(zhì)、DNA提取操作的影響。第2種方法是將標準菌株的16S rRNA/ITS/18S rRNA基因與質(zhì)粒載體連接，將重組質(zhì)粒做10倍梯度稀釋后作為模板進行qPCR擴增，用Ct值和重組質(zhì)?？截悢?shù)構(gòu)建標準曲線，此法更容易獲得線性關(guān)系良好的標準曲線，目前在食品病源微生物檢測中應(yīng)用較多，也應(yīng)用于四川泡菜[14]、西藏開菲爾粒[15]、鎮(zhèn)江香醋[16]等傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物數(shù)量變化過程分析，具有快速準確的優(yōu)點。

本研究將標準菌株的16S rRNA/ITS基因與質(zhì)粒載體連接作為標準參照物構(gòu)建標準曲線，建立qPCR檢測方法，檢測榨菜不同腌制時期腌制汁液中的細菌、真菌數(shù)量，同時檢測基本理化數(shù)據(jù)，探討整個腌制過程中細菌、真菌數(shù)量變化過程，為榨菜腌制工藝改進、提高過程控制水平提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

榨菜經(jīng)過3次腌制，分別在第1次腌制的第4、7天，第2次腌制的第5、12、20天，第3次腌制的第9、30、90、180(成品)天采集腌制汁液樣品。

1.2 標準菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,L.plantarum) ATCC 8014、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,S.cerevisiae) ATCC 9763：廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑、培養(yǎng)基和引物

AgNO3標準溶液(0.100 0 mol/L)，天津渤化化學(xué)試劑有限公司；NaOH、K2CrO4、酚酞，成都市科龍化工試劑廠；PremixTaq、TB GreenPremixExTaqⅡ、RNase-free Water、pMD19-T Vector Cloning Kit、DL 2 000 DNA Ladder Marker、E.coliCompetent Cells JM109，寶生物工程(大連)有限公司；IPTG溶液、X-Gal溶液，北京酷來搏科技有限公司；氨芐青霉素鈉、細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、酵母基因組DNA提取試劑盒(DP307)、深加工食品DNA提取試劑盒(DP326)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)、質(zhì)粒小提試劑盒(DP103)，天根生化科技(北京)有限公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基(g/L，乳酸菌增殖培養(yǎng)用)：蛋白胨 10.0、牛肉粉 8.0、酵母粉 4.0、葡萄糖 20.0、K2HPO42.0、檸檬酸氫二銨 2.0、乙酸鈉 5.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.04、吐溫80 1.0，pH 5.5～5.9，121 ℃高壓滅菌15 min。

YM培養(yǎng)基培養(yǎng)基(g/L，酵母菌增殖培養(yǎng)用)：胰蛋白胨 5.0、麥芽浸粉 3.0、葡萄糖 10.0、酵母浸粉 3.0，pH 6.0～6.4，121 ℃高壓滅菌15 min。

LB肉湯培養(yǎng)基(g/L，大腸桿菌增殖培養(yǎng)用)：胰蛋白胨 10.0、酵母浸粉 5.0、NaCl 10.0，pH 6.9～7.1，121 ℃高壓滅菌15 min。以上培養(yǎng)基均從青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司購入。

含抗生素的LB固體平板：100 mL LB培養(yǎng)基(加入1.5 g瓊脂粉)，經(jīng)過121 ℃、15 min滅菌后將溫度降到55 ℃，以無菌操作加入抗生素，制作LB固體平板[17]。

SOC培養(yǎng)基(g/L，促進感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化用)：胰蛋白胨 2.0、酵母浸粉 0.5、NaCl 0.05、KCl 0.2、MgCl21.0、葡萄糖3.6,購于寶生物工程(大連)有限公司。

引物：引物序列如表1所示，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.3.2 儀器

CFX96 Real-time PCR儀、T100 PCR儀、power pacbasic電泳儀,美國Bio-Rad公司；5810R高速冷凍離心機,德國Eppendorf股份公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SIM-F1制冰機,日本Sanyo有限公司；303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海葉拓儀器儀表有限公司；YCX-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；GR60DA立式自動壓力蒸汽滅菌鍋,美國Zealway有限公司；G:BOXEF凝膠成像系統(tǒng),美國Gene公司；P100/P100+超微量分光光度計,美國Pultton公司；Mini-Q超級純水儀,法國Synergy公司；ZWY-2102C雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司；pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品理化指標測定

pH值測定：每個樣品重復(fù)3次，結(jié)果取算術(shù)平均值[18]。

可滴定酸度測定：參照李嬌洋等[19]方法用NaOH標準溶液滴定，酚酞指示滴定終點，通過消耗的NaOH體積計算出可滴定酸含量。以乳酸計(TA,g/L)，如公式(1)所示：

(1)

式中：C1，NaOH標準溶液的濃度，mol/L；Vd1，用于滴定的樣品體積，mL；V1，滴定消耗的NaOH溶液體積，mL；V0，空白試驗消耗的NaOH溶液體積，mL；0.090：乳酸的換算系數(shù)。

NaCl的質(zhì)量濃度測定：用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至出現(xiàn)淺紅色，加入1 mL 10% K2CrO4溶液，邊搖邊滴加0.1 mol/L AgNO3標準溶液，溶液變?yōu)槌赛S色保持1 min不褪色即為終點[17]。結(jié)果用氯化物的質(zhì)量濃度(S，g/L)表示，計算公式(2)如下：

(2)

1.4.2 榨菜腌制汁液樣品基因組DNA的提取

取榨菜腌制水10 mL于離心管中，7 000 r/min離心10 min去上清，沉淀菌體用深加工食品DNA提取試劑盒提取宏基因組DNA，用超微量分光光度計測定DNA濃度，并且貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 標準質(zhì)粒構(gòu)建過程

L.plantarumATCC 8014用MRS肉湯培養(yǎng)，用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。S.cerevisiaeATCC 9763用YM肉湯培養(yǎng)，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

乳桿菌基因組DNA用引物8F和798R進行PCR擴增，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)細胞中，于SOC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取適量菌液涂布于含氨芐青霉素(100 g/L)、IPTG(20 g/L)、X-gal(50 g/L)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用藍白斑法篩選陽性克隆[19-20]。酵母菌基因組DNA用引物Y1和Y2進行ITS的PCR擴增，同法構(gòu)建重組質(zhì)粒。

A-pMD19-T-L. plantarum重組質(zhì)粒;B-pMD19-T-S. cerevisiae重組質(zhì)粒圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建模擬模型Fig.1 Construction simulation of recombinant plasmid

挑取白色陽性克隆菌落，用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，分別用338F、518R和Y1、Y2引物做PCR擴增驗證乳桿菌、酵母標準菌株構(gòu)建的質(zhì)粒，PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR buffer 12.5 μL，質(zhì)粒模板2 μL，10 μmol/L引物各0.8 μL，ddH2O 8.9 μL。以ddH2O代替質(zhì)粒作為陰性對照。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，擴增40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將陰性對照、質(zhì)粒擴增產(chǎn)物、pMD19-T質(zhì)粒(空載)、重組質(zhì)粒一起點樣電泳，通過條帶的相對位置驗證插入序列。

經(jīng)檢驗含有適當插入序列的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司用M4和RV引物測序驗證。將測出的序列與插入序列輸入ClustalW網(wǎng)頁(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)做序列比對，比對文件輸入ENDscript/ESPript網(wǎng)頁(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)生成序列比對圖。

1.4.4 qPCR標準曲線的構(gòu)建

用超微量分光光度計測重組質(zhì)粒的濃度，按公式(3)計算拷貝數(shù)(copies/μL)：

(3)

式中：DNA濃度單位為ng/μL；DNA長度單位為bp(乳桿菌重組質(zhì)粒為3 842 bp,酵母重組質(zhì)粒為2 834 bp)。

將重組質(zhì)粒作10倍梯度稀釋，稀釋液作為DNA模板做qPCR擴增，細菌和真菌的反應(yīng)體系(20 μL)均為：TB GreenPremixExTaqⅡ 10 μL，DNA模板2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。細菌的引物為338F和518R，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性45 s；94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，擴增45個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。真菌的引物為Y1和Y2，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性45 s；94 ℃、15 s，58 ℃、 15 s，72 ℃、15 s，擴增45個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。在擴增結(jié)束時設(shè)置熔解曲線步驟以確定產(chǎn)物的特異性。每個實驗重復(fù)5次。

根據(jù)Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)構(gòu)建標準曲線，評價標準曲線的線性系數(shù)、線性范圍和擴增效率[21]。擴增效率(E)與標準曲線的斜率(K)相關(guān),如公式(4)所示：

(4)

1.4.5 榨菜腌制汁液中細菌和真菌數(shù)量的檢測

采用建立的qPCR反應(yīng)方法檢測腌制汁液樣品中的細菌和真菌的數(shù)量，3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析，結(jié)果采取均值±標準差形式。用Origin 2017軟件進行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 榨菜腌制汁液理化指標的變化過程分析

榨菜的3次腌制采用不同的NaCl的質(zhì)量濃度。第1次腌制時，青菜頭拌鹽后，隨著菜塊中的汁液在食鹽的高滲作用下流出和鹽的溶解過程，腌制汁液的NaCl的質(zhì)量濃度從8.99 g/L上升到17.13 g/L，pH值由6.72快速下降到5.08，酸度從0.06 g/L增加到1.82 g/L，表明這一時期微生物快速產(chǎn)酸。第2次腌制時，腌制水的NaCl的質(zhì)量濃度從41.42 g/L逐漸降低到30.03 g/L，可能因為相對于第1次腌制時NaCl的質(zhì)量濃度有所提高，菜塊中大量水滲出使鹽濃度稀釋，因此呈現(xiàn)一個下降的過程，pH值從4.65緩慢增加到了5.24，可滴定酸從5.14 g/L增加到5.78 g/L，末期下降到3.44 g/L，表明這一時期微生物也發(fā)酵產(chǎn)酸，可能也因為菜塊水滲出的稀釋作用而使酸濃度略有下降。第3次腌制時，腌制水中NaCl的質(zhì)量濃度從71.36 g/L下降到62.48 g/L，再增加到67.31 g/L，pH值持續(xù)下降，從5.04降到了4.43，可滴定酸度從6.15 g/L增加到7.00 g/L，再下降到3.82 g/L，表明盡管受到高鹽濃度的抑制作用，微生物仍然繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸。最后，3Y180d(成品)樣品經(jīng)過一定的脫鹽步驟后，NaCl的質(zhì)量濃度為36.23 g/L，pH值為4.24，可滴定酸度為3.91 g/L。

A-pH值;B- NaCl質(zhì)量濃度;C-可滴定酸度圖2 榨菜腌制過程中理化指標的變化Fig.2 Physical and chemical indicators in the curing process of Zhacai

2.2 標準質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證

分別用標準菌株L.plantarumATCC 8014的16S rRNA基因和S.cerevisiaeATCC 9763的ITS基因與質(zhì)粒pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用藍白斑法篩選陽性克隆(圖3)。圖3-A中菌落幾乎都是白色，而圖3-B中藍色菌落較多，表明乳桿菌重組質(zhì)粒的連接轉(zhuǎn)化效率較高。

重組質(zhì)粒的PCR擴增和電泳驗證實驗結(jié)果如圖4所示。陰性PCR擴增沒有條帶，隨機挑選的3個乳桿菌重組質(zhì)粒擴增均在180 bp處顯示條帶，重組質(zhì)粒(第6泳道)相對于空載質(zhì)粒(第5泳道)處于凝膠中分子質(zhì)量稍低的位置，這是由于pMD19-T空載質(zhì)粒是開環(huán)線性的，在凝膠中泳動受到的空間位阻較大，而重組質(zhì)粒是閉合環(huán)狀的，在凝膠中的空間位阻較小。酵母菌重組質(zhì)粒的電泳圖與乳桿菌相似，其陽性擴增條帶位于150 bp。

A-pMD19-T-L. plantarum重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的JM109;B-pMD19-T-S. cerevisiae重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的JM109圖3 藍白斑篩選重組質(zhì)粒Fig.3 The recombinant clones were screened by white-blue plaque selection method

A-pMD19-T-L. plantarum重組質(zhì)粒驗證;B-pMD19-T-S. cerevisiae重組質(zhì)粒驗證圖4 PCR和電泳驗證重組質(zhì)粒Fig.4 PCR and electrophoretic profile of recombinant plasmid注：M-DL2 000 DNA Ladder Marker；1-陰性對照；2、3、4-重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；5-pMD19-T質(zhì)粒(空載)；6-pMD19-T重組質(zhì)粒。

乳桿菌重組質(zhì)粒與L.plantarumATCC 8014的16S rRNA基因、酵母菌重組質(zhì)粒與S.cerevisiaeATCC 9763的ITS基因序列比對的相似性都為100%，如圖5所示，進一步證明目標序列正確插入質(zhì)粒載體中。

2.3 qPCR定量檢測方法的建立

將乳桿菌重組質(zhì)粒做10倍梯度稀釋后用于qPCR擴增，基線平整，擴增曲線呈S型，熔解曲線為單一熔解峰(圖6-A、圖6-B)，說明無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，標準曲線為Ct=-3.408 7lgC+35.793,相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 9，擴增效率E=96.5%，線性范圍是3.64×104～3.62×109copies/μL。酵母菌重組質(zhì)粒的qPCR擴增曲線也呈S型，熔解曲線為單峰(圖6-C、圖6-D)，標準曲線為Ct=-3.227 8lgC+35.294,相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 9，擴增效率E=104.1%，線性范圍是7.07×102～7.07×109copies/μL。FREDLUND等[22]和SUANTHIE等[23]報道，可以根據(jù)如下標準判斷qPCR標準曲線是否構(gòu)建成功：斜率在-3.1～-3.6，PCR擴增效率在80%～110%，R2≥0.98。用乳桿菌、酵母菌重組質(zhì)粒構(gòu)建的標準曲線均符合上述標準，可分別應(yīng)用于樣品中細菌、真菌數(shù)量的檢測。

A-pMD19-T-L. plantarum重組質(zhì)粒驗證；B-pMD19-T-S. cerevisiae重組質(zhì)粒驗證圖5 重組質(zhì)粒基因序列比對驗證Fig.5 Comparison and validation of recombinant plasmid gene sequence

2.4 榨菜腌制汁液中細菌和真菌數(shù)量的檢測

采用建立的qPCR方法檢測腌制汁液樣品中細菌和真菌的數(shù)量，結(jié)果如圖7所示。

第1次腌制時，細菌數(shù)量從109.28copies/μL上升到1010.43copies/μL，這一時期細菌快速增殖。真菌的數(shù)量一直保持于106copies/μL。第2次腌制時，細菌的初始數(shù)量為108.10copies/μL，細菌數(shù)量的急劇降低可能是由于菜塊轉(zhuǎn)池并且用量鹽提高，此后細菌數(shù)量逐漸增加至109.11copies/μL，表明在較高NaCl的質(zhì)量濃度下細菌以比較緩慢的速度增殖。真菌數(shù)量最初保持于106copies/μL，第20天時急劇下降至105.29copies/μL，可能部分真菌對鹽耐受性較低而被抑制。第3次腌制時，細菌的初始數(shù)量為109.49copies/μL，先升高至1010.13copies/μL，然后略有下降，最終穩(wěn)定至109.92copies/μL，在較高NaCl的質(zhì)量濃度下細菌仍然緩慢增殖并且數(shù)量保持在較高的水平。真菌數(shù)量從105.97copies/μL穩(wěn)步增加至107.75copies/μL，最終3Y180d(成品)為107.26copies/μL。

在整個腌制過程中，細菌數(shù)量高于真菌數(shù)量，3個腌制時期都有明顯的數(shù)量增殖過程，表明細菌對于發(fā)酵過程是最主要的貢獻者。第3次腌制時真菌才有明顯的數(shù)量增殖過程，表明真菌在后熟階段也發(fā)揮了重要的作用。細菌數(shù)量在1Y7d、2Y20d達到較高水平時，真菌數(shù)量均降低，細菌數(shù)量在2Y5d、3Y90d較低時，真菌數(shù)量略有上升，由此可推測細菌增殖可能對真菌有一定的抑制作用。

A、B-L. plantarum重組質(zhì)粒的擴增曲線和熔解曲線;C、D-S. cerevisiae重組質(zhì)粒的擴增曲線和熔解曲線圖6 重組質(zhì)粒的qPCR擴增曲線和熔解曲線Fig.6 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of bacterial and fungi

圖7 榨菜腌制過程中細菌和真菌數(shù)量變化過程Fig.7 The change of the quantity of bacteria and fungi during the curing process

本研究用qPCR法檢測出第3次腌制期間細菌、真菌的數(shù)量都比較高，在腌制末期(3Y90d、3Y180d)僅僅略微降低，而現(xiàn)有的文獻報道，后熟末期(60～180 d)細菌從106個/g下降至102個/g[5]，或者從105個/g下降至103個/g[6]。結(jié)果的差異可能是因為腌制末期鹽濃度很高，檢測培養(yǎng)基與腌制汁液環(huán)境差異較大，不適宜部分微生物的生長[24]，qPCR技術(shù)是一種免培養(yǎng)技術(shù)，不受微生物可培養(yǎng)性的影響。

3 結(jié)論

榨菜是我國著名的傳統(tǒng)醬腌制品，其獨特的風(fēng)味和品質(zhì)深受人們的喜愛。微生物發(fā)酵作用對其風(fēng)味品質(zhì)的形成有著重要的影響。本研究構(gòu)建了qPCR檢測方法，檢測榨菜不同腌制時期腌制汁液中的細菌、真菌數(shù)量，探討了3個腌制階段細菌、真菌數(shù)量變化過程。細菌的數(shù)量變化范圍是108.10～1010.43copies/μL，在3個腌制階段中細菌都有明顯的數(shù)量增殖過程；真菌的數(shù)量變化范圍是105.29～107.75copies/μL，僅在第3次腌制期間有明顯的數(shù)量增殖過程。同時分析了腌制過程中NaCl的質(zhì)量濃度、pH值、酸度的變化過程。本研究采用qPCR方法，反映榨菜腌制汁液中所有可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的數(shù)量，為進一步研究不同菌屬在榨菜發(fā)酵中所起到的作用提供一定的理論基礎(chǔ)，同時也對榨菜腌制工藝改進、提高過程控制水平具有重要的參考意義。