初探流體切應(yīng)力在肝癌細(xì)胞遷移中的作用

劉子逸 戴征偉 王利娟 閆志平 徐彬△

(1. 成都市第七中學(xué)高新校區(qū)，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲受到腫瘤組織所處腫瘤微環(huán)境的影響[1]。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤周圍的組織、免疫細(xì)胞、血管、細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分[2,3]。力學(xué)微環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。由于腫瘤組織中血管發(fā)育不良、內(nèi)皮層不完善，使腫瘤細(xì)胞直接暴露于流動(dòng)的組織間液中[5]。研究表明，腫瘤細(xì)胞受到的流體切應(yīng)力大約為0.01～0.2 Pa[6]。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種廣泛參與機(jī)體生理調(diào)節(jié)和病理性改變的重要機(jī)制[7]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，失去其上皮樣特征，而獲得間充質(zhì)樣表型。EMT使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)和極性改變，細(xì)胞骨架發(fā)生重排，進(jìn)而提升了腫瘤細(xì)胞的遷移能力[8-9]。緊密連接常見于上皮細(xì)胞中，主要起到固定細(xì)胞，輔助細(xì)胞極性，以及防止小分子穿越細(xì)胞間隙的作用[10]。緊密連接相關(guān)蛋白包括Claudin-5、Occludin、ZO-1等，這類蛋白表達(dá)的降低，代表著腫瘤上皮表型的失去，以及細(xì)胞間通透性的升高[11]。

本研究以肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)條件下，利用平行平板流動(dòng)腔提供穩(wěn)定層流切應(yīng)力，對(duì)HepG2細(xì)胞施加1.4 dyn·(cm2)-1流體切應(yīng)力作用，研究流體切應(yīng)力對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。在此基礎(chǔ)上，分析其細(xì)胞間緊密聯(lián)接的變化以及上皮、間充質(zhì)標(biāo)志物的變化，初步探討流體切應(yīng)力誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室保存；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Invitrogen公司；一抗(E-鈣粘蛋白，N-鈣粘蛋白)購自Sana Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗、FITC標(biāo)記熒光二抗購自中杉金橋公司；細(xì)胞核染料DAPI購自賽默飛公司；顯影液ECL plus購自碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、鏈霉素(100 mg·(mL)-1)、青霉素(1×105U·L-1)的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，并置于37℃恒溫、5%CO2含量孵箱中，飽和濕度，靜止條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化后傳代再培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為2×105個(gè)·(mL)-1，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 流體切應(yīng)力加載實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中的流體切應(yīng)力由平行平板流動(dòng)腔提供[12]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置包括蠕動(dòng)泵、儲(chǔ)液瓶、橡膠管道及單層流動(dòng)腔。蠕動(dòng)泵為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了穩(wěn)定的定常流(Steady flow)，灌流液體為無血清RPMI1640(37℃時(shí)，粘度為0.83 mPa·s-1)。將HepG2細(xì)胞接種于75 mm×25 mm的載玻片上，待細(xì)胞融合至90%后，將玻片置于平行平板流動(dòng)腔，并通過蠕動(dòng)泵控制培養(yǎng)基的流速。加載切應(yīng)力時(shí)，整個(gè)流場溫度保持37℃，緩沖體系可維持pH(7.2-7.4)。灌流系統(tǒng)的相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)前期計(jì)算并校正，實(shí)驗(yàn)選取流體切應(yīng)力為1.4 dyn·(cm2)-1。實(shí)驗(yàn)分組按照切應(yīng)力加載時(shí)間分為：靜態(tài)培養(yǎng)的對(duì)照組、加力2 h組、4 h組、8 h組以及先力學(xué)加載再力學(xué)松弛的8 h+4 h組和8 h+8 h組(即加載力8 h后再分別靜態(tài)培養(yǎng)4 h、8 h)。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移能力變化

對(duì)HepG2細(xì)胞加載1.4 dyn·(cm2)-1大小的流體切應(yīng)力，分別作用2 h、4 h和8 h后，從平行平板流動(dòng)腔取出玻片，行劃痕實(shí)驗(yàn)，洗滌后置于培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)，取培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h和24 h各時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞遷移情況，并與靜態(tài)培養(yǎng)的對(duì)照組比較。

1.5 免疫熒光法觀察細(xì)胞骨架F-actin變化

HepG2細(xì)胞不同組處理后，PBS漂洗2次·(5 min)-1，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗3次·(5 min)-1孵育一抗(E-鈣粘蛋白，N-鈣粘蛋白)，4℃過夜。PBS漂洗3次·(5 min)-1，孵育熒光二抗，37℃、0.5 h，PBS漂洗3遍·(5 min)-1，37℃孵育DAPI 15 min。最后加入熒光封片劑，制片。樣品利用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，Germany)觀察。

1.6 Western Blot測定相關(guān)蛋白表達(dá)變化

HepG2細(xì)胞不同組處理后，PIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和PMSF)裂解細(xì)胞，收集蛋白。BCA定量后，加入上樣緩沖液，100℃變性8 min。經(jīng)跑膠、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗；4℃過夜。TBST漂洗3遍，孵育二抗；TBST漂洗3遍，加入ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。用Image J分析蛋白條帶，用光密度比值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 透射電鏡觀察細(xì)胞間緊密連接的變化

PBS漂洗細(xì)胞，細(xì)胞刮子收集細(xì)胞入1.5 mL離心管中，用2000 r·(min)-1，離心15 min，棄上清。沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛固定液，在4℃環(huán)境中靜置10 min。12000 r·(min)-1，離心15 min，棄上清。再沿壁緩慢加入3%戊二醛固定液。制作好細(xì)胞樣品，送至透射電鏡實(shí)驗(yàn)室待檢。選取5000×倍數(shù)下的三張TEM圖片，計(jì)算細(xì)胞與細(xì)胞間緊密連接的距離。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 流體切應(yīng)力對(duì)HepG2遷移的影響

對(duì)照組HepG2細(xì)胞遷移距離在8 h內(nèi)無顯著性差異，12 h后遷移距離與0 h、4 h、8 h比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。切應(yīng)力作用2 h組與對(duì)照組相比，4 h時(shí)間點(diǎn)的遷移距離與2 h時(shí)間點(diǎn)比較即出現(xiàn)顯著的差異，時(shí)間越長，遷移距離遠(yuǎn)大。加力4 h組及8 h組與對(duì)照組相比，在2 h時(shí)間點(diǎn)即發(fā)生明顯的遷移(P<0.05)，時(shí)間越長，遷移距離遠(yuǎn)大。因此，流體切應(yīng)力促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移，遷移距離隨著切應(yīng)力加載時(shí)間的延長而增大，見圖1。

2.2 流體切應(yīng)力對(duì)HepG2細(xì)胞骨架F-actin的影響

流體切應(yīng)力可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞骨架的重排，從而改變細(xì)胞形態(tài)，并促進(jìn)了細(xì)胞的遷移。通過對(duì)F-actin染色發(fā)現(xiàn)(圖2)，對(duì)照組肝癌細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞骨架未見明顯的絲狀結(jié)構(gòu)。切應(yīng)力加載后，細(xì)胞鋪展拉伸，呈長梭形，面積增加，并且在流體切應(yīng)力方向上形成明顯的應(yīng)力纖維。撤銷切應(yīng)力4 h及8 h后，細(xì)胞應(yīng)力纖維逐漸消失，但F-actin的排列仍保持規(guī)整。以上結(jié)果表明，流體切應(yīng)力誘導(dǎo)HepG2骨架重排，有利于肝癌細(xì)胞的遷移。

圖2 流體切應(yīng)力對(duì)HepG2細(xì)胞骨架F-actin的影響注：a：靜態(tài)對(duì)照組；b：2 h組；c：4 h組；d：8 h組；e：8h+4h組；f：8 h+8 h組圖中黃色和紅色箭頭分別表示細(xì)胞邊緣板狀偽足和絲狀偽足，白色箭頭代表流動(dòng)方向(綠色：細(xì)胞骨架；藍(lán)色：細(xì)胞核)。

2.3 流體切應(yīng)力對(duì)HepG2細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

上皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)與間質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)是細(xì)胞發(fā)生EMT最顯著的標(biāo)志。圖3描述了HepG2細(xì)胞加載流體切應(yīng)力后，E-Cadherin和N-Cadherin表達(dá)的時(shí)序性變化規(guī)律。

從圖3a可見，靜態(tài)培養(yǎng)組E-Cadherin以及N-Cadherin主要分布在細(xì)胞膜周圍，隨著切應(yīng)力加載時(shí)間的增加，E-Cadherin的表達(dá)強(qiáng)度呈降低的趨勢，而N-Cadherin的表達(dá)強(qiáng)度呈升高趨勢；加載流體切應(yīng)力8 h后，對(duì)細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)即力學(xué)松弛4 h以及8 h后觀察可見，E-Cadherin的表達(dá)強(qiáng)度有所恢復(fù)而N-Cadherin表達(dá)強(qiáng)度有所降低。

由圖3b可以看出，上皮標(biāo)志物E-Cadherin在切應(yīng)力作用2 h后表達(dá)下調(diào)至較低水平，并維持這種低水平至8 h，撤銷切應(yīng)力后其表達(dá)水平顯著升高。但是，力學(xué)松弛8 h后其表達(dá)水平仍然顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P<0.05)。間充質(zhì)標(biāo)志物N-Cadherin在力學(xué)刺激2 h內(nèi)其表達(dá)水平無明顯變化，隨著加力時(shí)間的延長其表達(dá)逐漸升高，到8 h時(shí)表達(dá)達(dá)到峰值，且與對(duì)照比較具有顯著性差異(P<0.05)。Vimentin在力學(xué)刺激2 h顯著上調(diào)，隨著切應(yīng)力加載保持高水平表達(dá)，撤銷切應(yīng)力后Vimentin的表達(dá)變化不明顯，這與圖2免疫熒光結(jié)果基本一致，即切應(yīng)力使骨架重排后。撤銷力學(xué)加載4 h和8 h，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)依然保持規(guī)整的狀態(tài)。此外，間充質(zhì)標(biāo)志物Twist和Snail的表達(dá)規(guī)律基本一致，均在2 h內(nèi)表達(dá)升高，8 h達(dá)到峰值，撤銷切應(yīng)力后其表達(dá)逐漸降低并且低于對(duì)照組水平(P<0.05)。Western blot與免疫熒光結(jié)果的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明流體切應(yīng)力能夠影響E-Cadherin以及N-Cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，但EMT相關(guān)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)存在時(shí)序差異性。

圖3 流體切應(yīng)力對(duì)HepG2細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響注：a：免疫熒光雙染分析切應(yīng)力作用后，N-cadherin(紅色)及E-cadherin(綠色)分布的變化；藍(lán)色為細(xì)胞核，黃色箭頭所指為局部放大圖中觀察到的E-cadherin/N-cadherin熒光的分布和表達(dá)；b：切應(yīng)力作用后，EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的變化。

2.4 流體切應(yīng)力對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞間緊密連結(jié)的影響

圖4為1.4 dyn·(cm2)-1流體切應(yīng)力作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞間緊密連結(jié)的影響。由圖可知，對(duì)照組細(xì)胞間連接(黑色箭頭)完整，平均寬度約20±1.0 nm。加載切應(yīng)力2 h后，細(xì)胞間的緊密連接出現(xiàn)破壞，細(xì)胞間連接不再完整，平均寬度增至28±6.5 nm。加載切應(yīng)力4 h后，細(xì)胞間出現(xiàn)了更為明顯的空隙，細(xì)胞連接不完整，其平均寬度增加為135±13 nm，與對(duì)照組相比有明顯的差異(P<0.05)。加載切應(yīng)力8 h后，細(xì)胞間的空隙進(jìn)一步增大。撤銷切應(yīng)力，細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)4 h后觀察細(xì)胞間連接有所恢復(fù)，空隙明顯小于加力8 h后的空隙寬度，平均寬度為232.5±13.5 nm。撤銷切應(yīng)力，細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞間連接寬度繼續(xù)減小，其平均寬度為128±15 nm。因此，流體切應(yīng)力誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞緊密連接破壞，提高了連接空隙寬度，從而增大了肝癌細(xì)胞通透性，有利于細(xì)胞遷移。

圖4 流體切應(yīng)力對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞緊密連接的影響注：a：流體切應(yīng)力作用對(duì)細(xì)胞緊密連接形態(tài)的影響(左圖5000×，右圖20000×)；b：流體切應(yīng)力作用對(duì)細(xì)胞間緊密連接平均寬度的影響，*P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是造成癌癥患者治療失敗和高死亡率的主要原因。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過程，而EMT是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，進(jìn)行局部浸潤或者沿血道和淋巴道轉(zhuǎn)移的先決條件[13]。在EMT發(fā)生過程中，腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的表型，如粘附分子的失去等，失去了與基底膜或其他細(xì)胞的連接，致使細(xì)胞去極化，細(xì)胞骨架重排[8]，從而獲得較高的遷移和侵襲能力，同時(shí)抗凋亡能力和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力也同步增強(qiáng)[14]。

在當(dāng)今腫瘤的研究領(lǐng)域，絕大多數(shù)研究關(guān)注于腫瘤微環(huán)境中的生物學(xué)因素和化學(xué)因素。而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤微環(huán)境的力學(xué)因素，包括流體切應(yīng)力，基質(zhì)硬度等均發(fā)生了較大的變化[15]，力學(xué)因素影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而這一方面研究較少。我們利用蠕動(dòng)泵和平板流動(dòng)腔，在體外培養(yǎng)條件下，給予肝癌細(xì)胞HepG2流體切應(yīng)力的刺激，研究切應(yīng)力對(duì)肝癌細(xì)胞EMT和遷移的影響。我們的結(jié)果表明，切應(yīng)力上調(diào)肝癌細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)志物，下調(diào)上皮標(biāo)志物，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT；切應(yīng)力作用下，肝癌細(xì)胞胞間緊密連接的距離增加，肝癌細(xì)胞通透性增加；同時(shí)，切應(yīng)力促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。我們的研究結(jié)果從細(xì)胞和分子層面證明，流體切應(yīng)力是誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT和遷移的重要物理學(xué)因素，值的一提的是，有研究表明，肝癌組織內(nèi)的細(xì)胞感受到比正常肝組織更大的流體切應(yīng)力[5]，提示我們，在肝癌原發(fā)灶轉(zhuǎn)移的過程中，物理學(xué)因素，尤其是流體切應(yīng)力的作用不可忽略。

因此，流體切應(yīng)力誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT，提高肝癌細(xì)胞通透性，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。本文初步研究了流體切應(yīng)力誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，將有助加深人們于對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的力學(xué)生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。