辛伐他汀協(xié)同單軸靜態(tài)牽張力促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨基因表達(dá)*

楊孝勤 李正強(qiáng) 陳軍 方煒 馬偉群 萬(wàn)荻 鄭俊發(fā)

(南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510280)

被稱為“內(nèi)源性骨組織工程”的牽張成骨避免了自體骨組織移植需開辟第二術(shù)區(qū)和人工材料植入的免疫排斥反應(yīng)及強(qiáng)度不夠等缺點(diǎn)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)周圍軟組織的同步擴(kuò)展等優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)成為一種治療正頜外科、頜骨重建、口腔種植治療頜骨畸形和頜骨缺損的重要方法[1]。然而，牽張成骨作為一種新技術(shù)，在許多方面還需深入研究，主要有牽張成骨仍存在固定期過長(zhǎng)、新骨形成不良等弊端，如何縮短治療時(shí)間，減少并發(fā)癥，提高再生骨質(zhì)量成為當(dāng)前牽張成骨需要解決的最大難題。目前眾多學(xué)者采取了多種輔助方法[2,3]，盡管部分方法獲得了一定的效果，然而均未能獲得廣泛的臨床運(yùn)用，存在各種各樣的問題，如：技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高、周期長(zhǎng)、生物學(xué)不安全等缺點(diǎn)。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、安全的方法來(lái)促進(jìn)骨組織再生仍是目前牽張成骨研究領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。

辛伐他汀則是臨床上最常用的他汀類藥物，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，有很好的降高血脂、高膽固醇作用，已在臨床上應(yīng)用20多年，具有高度的生物安全性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能通過誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogeneticprotein，BMP)促進(jìn)成骨，已被應(yīng)用于修復(fù)骨折和骨缺損取得了較好的效果。因此，本研究擬利用本課題組建立的多單元細(xì)胞拉伸裝置評(píng)估辛伐他汀能否協(xié)同單軸靜態(tài)牽張力促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨基因表達(dá)，為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器

多單元細(xì)胞拉伸裝置由四川大學(xué)與電子科技大學(xué)聯(lián)合研制，新生SD大鼠由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，性別不限，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑與材料購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑購(gòu)于Takara公司，Ⅰ型鼠尾膠原蛋白、辛伐他汀購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 多單元細(xì)胞拉伸裝置

多單元細(xì)胞拉伸裝置是本課題組與電子科技大學(xué)聯(lián)合研制。多單元細(xì)胞拉伸裝置，由控制單元、顯示單元、按鍵單元、驅(qū)動(dòng)單元、動(dòng)力加載單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元、向控制單元和驅(qū)動(dòng)單元提供工作電流的電源組成，見圖1。根據(jù)本課題組以前研究提示10%單軸靜態(tài)牽張力促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨基因表達(dá)最強(qiáng)[4]。因此，本研究選擇用10%單軸靜態(tài)牽張力。

圖1 多單元細(xì)胞拉伸裝置

1.3 成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用兩步酶消化法原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞[5]。簡(jiǎn)言之，將新生1-2 d SD大鼠的顱蓋骨剪碎成約0.5 mm2大小的骨碎片。加入質(zhì)量濃度0.25%胰蛋白酶1 mL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)消化后棄除消化上清液，再加入1 mg·mL-1Ⅱ型膠原酶溶液1 mL，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min，收集消化上清液1000×g離心5 min，將收集到的細(xì)胞混勻后，按細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)細(xì)胞/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋程度達(dá)到培養(yǎng)瓶底面積的80%時(shí)，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將3-6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)法、四環(huán)素和茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與方法

將第3-6代的2 mL含2×104個(gè)·mL-1成骨細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)包被了Ⅰ型鼠尾膠原蛋白的硅膠膜上的硅膠膜矩形環(huán)內(nèi)。37oC，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后細(xì)胞已完全貼壁于硅膠膜上，取出硅膠膜矩形環(huán)，補(bǔ)加10 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后對(duì)成骨細(xì)胞施加10%的單軸靜態(tài)牽張力或培養(yǎng)在含10-7mol·L-1辛伐他汀的培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為Stretch組、Sim組、Stretch+辛伐他汀組和Ctrl組。其中Stretch組為10%單軸靜態(tài)牽張力，Sim組為10-7mol·L-1辛伐他汀，Stretch+Sim組為10%單軸靜態(tài)牽張力合并10-7mol·L-1辛伐他汀，Ctrl組為未處理的對(duì)照組。加力3 d后收集細(xì)胞，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)runx 2、alp基因表達(dá)

按照HiFi-MMLV cDNA 第1鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture說明書進(jìn)行操作。runx2(NM_053470.2)上游引物：5’-cttcgtcagcgtcctatcagttc-3’，下游引物：5’-cagcgtcaacaccatcattctg-3’；alp(NM_013059.1)上游引物：5’-gaccctgccttaccaactcatt-3’，下游引物：5’-gtggagacgcccataccatct-3’；GAPDH(XR_009170.1)上游引物：5’-tatgactctacccacggcaagt-3’，下游引物：5’-atactcagcaccagcatcacc-3’。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按以下條件擴(kuò)增：95℃預(yù)變性8 min；95℃變性15 s、60℃退火、延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析為95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 新生SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

如圖2a所示，新生SD大鼠顱骨原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞多呈梭形、三角形或星形的不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)飽滿，邊界清晰，表面較光滑。成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)后逐漸伸展變形，胞體逐漸展開成短梭形，繼而變成星形或多極形(圖2b)。圖2c示alp染色實(shí)驗(yàn)，成骨細(xì)胞染色后核呈紫色，胞漿出現(xiàn)中等量的紅棕色顆粒，有些為咖啡色或棕褐色顆粒。圖2d顯示了Ⅰ型膠原表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色，可見細(xì)胞呈Ⅰ型膠原強(qiáng)陽(yáng)性。圖2e示成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)四環(huán)素染色，熒光顯微鏡觀察可見鈣化結(jié)節(jié)呈明亮的黃色熒光。圖2f顯示鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色，成骨細(xì)胞是非接觸抑制性生長(zhǎng)，4-5周時(shí)細(xì)胞匯合呈復(fù)層生長(zhǎng)，局部堆積形成灶狀白色鈣化結(jié)節(jié)，用茜素紅染色鮮紅者表明為鈣化組織。

圖2 新生SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定結(jié)果注：a，原代成骨細(xì)胞倒置相差顯微鏡下觀×10；b，傳代成骨細(xì)胞倒置相差顯微鏡下觀×100；c，成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色普通顯微鏡下觀×100；d，成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色普通顯微鏡下觀×100；e，成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)四環(huán)素染色熒光顯微鏡下觀×40；f，成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色普通顯微鏡下觀×40。

2.2 辛伐他汀增強(qiáng)單軸靜態(tài)牽張力誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的runx 2、alp mRNA的表達(dá)

通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞runx2、alpmRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖3a，b所示，相對(duì)對(duì)照組，10%單軸靜態(tài)牽張力、10-7mol·L-1辛伐他汀能分別誘導(dǎo)成骨細(xì)胞runx2、alpmRNA的表達(dá)增加(P<0.05)。進(jìn)一步結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-7mol·L-1辛伐他汀與10%單軸靜態(tài)牽張力共同作用下成骨細(xì)胞runx2、alpmRNA的表達(dá)要比單獨(dú)10-7mol·L-1辛伐他汀或10%單軸靜態(tài)牽張力顯著提高(P<0.05)，見圖3a，b。

圖3 成骨細(xì)胞runx2、alp mRNA的表達(dá)水平注：*P<0.05。

3 討論

牽張成骨是通過切開骨皮質(zhì)后一周逐漸牽拉骨痂以延長(zhǎng)骨的方法，是利用骨組織細(xì)胞在受到張應(yīng)力刺激時(shí)活化、增殖，原位再生一段新骨的生物原理發(fā)展起來(lái)的一種新的骨發(fā)育不足與缺損修復(fù)方法，在口腔頜面整復(fù)外科領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。然而，牽張成骨作為一種新技術(shù)，在許多方面還需深入研究，主要有牽張成骨骨再生過程涉及的細(xì)胞和信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，其在細(xì)胞和分子水平上的生物學(xué)機(jī)制尚未闡明。其次，牽張成骨仍存在固定期過長(zhǎng)、新骨形成不良等弊端，限制了該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用和推廣。因此，探索牽張成骨骨再生的細(xì)胞和分子機(jī)制，尋求有效措施促進(jìn)牽張成骨骨再生，縮短治療周期，減少骨形成不良等并發(fā)癥，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者探索的一個(gè)重要前沿課題。本研究利用已建立的多單元細(xì)胞拉伸裝置對(duì)成骨細(xì)胞施加10%單軸靜態(tài)牽張力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%單軸靜態(tài)牽張力促進(jìn)了成骨細(xì)胞的成骨相關(guān)基因runx2和alpmRNA表達(dá)。這與Yang等[6]研究結(jié)果一致，他們通過Flexcell加力系統(tǒng)對(duì)成骨樣細(xì)胞施加最大幅度為10%的周期性間斷性張應(yīng)力，表明周期性間斷性張應(yīng)力增強(qiáng)了人牙周膜細(xì)胞的runx2、alpmRNA的表達(dá)。由于在牽張成骨過程中細(xì)胞所受的牽張力應(yīng)是單軸靜態(tài)持續(xù)的，因此本課題使用單軸靜態(tài)牽張力可能更能模擬成骨細(xì)胞在牽張成骨過程中所受的力學(xué)刺激。

Mundy等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)3萬(wàn)多種天然化合物進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)他汀類藥物(尤其是辛伐他汀和洛伐他汀)是唯一具有促進(jìn)骨形成代謝作用的天然藥物，可以增強(qiáng)BMP-2啟動(dòng)子活性，促進(jìn)堿性磷酸酶活性升高和礦化結(jié)節(jié)形成，促進(jìn)骨形成[7]。他汀類藥物由小而穩(wěn)定的分子組成，不易被蛋白水解，易于合成，而且價(jià)格便宜。研究證明，辛伐他汀具有良好的促成骨作用，不但可以改善全身的骨代謝狀態(tài)，而且可以增強(qiáng)局部骨修復(fù)效能，同時(shí)可以抑制破骨細(xì)胞的骨吸收相關(guān)途徑，進(jìn)一步促進(jìn)成骨作用[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-7mol·L-1辛伐他汀能增加成骨細(xì)胞的成骨相關(guān)基因runx2和alpmRNA表達(dá)。

目前眾多學(xué)者采取了多種輔助方法如物理方法(電刺激、電磁刺激、機(jī)械刺激、高壓氧、低強(qiáng)度脈沖超聲刺激等)、生長(zhǎng)因子和激素(骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、降血鈣素等)、細(xì)胞移植(自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞等)、組織工程法(自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合血小板豐富的血漿和人凝血酶凝膠)、藥物(二膦酸鹽、硫酸鈣等)[3,9,10]。盡管部分方法獲得了一定的效果，然而均未能獲得廣泛的臨床運(yùn)用，存在各種各樣的問題，如：技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用高、周期長(zhǎng)、生物學(xué)不安全等缺點(diǎn)。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)、安全的方法來(lái)促進(jìn)骨組織再生仍是目前牽張成骨研究領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。辛伐他汀具有良好的促成骨作用，同時(shí)具有生物安全性高、易于合成和價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)。本課題組對(duì)培養(yǎng)在含10-7mol·L-1辛伐他汀的培養(yǎng)液的成骨細(xì)胞施加將10%單軸靜態(tài)牽張力，結(jié)果表明辛伐他汀能協(xié)同10%單軸靜態(tài)細(xì)胞牽張力上調(diào)成骨細(xì)胞的成骨基因runx2、alpmRNA的表達(dá)，為后續(xù)的辛伐他汀促進(jìn)頜骨牽張成骨的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。