一測多評法測定番石榴葉中6種黃酮類成分的含量

方 皓，熊素琴，燕娜娜，陳 林，陳鴻平，劉友平

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137

番石榴葉為桃金娘科番石榴屬喬木番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的葉，具有澀腸止瀉、收斂止血的功效，用于治療泄瀉，下痢不止，濕疹騷癢，跌打損傷，創(chuàng)傷出血[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，番石榴葉中含有的黃酮類、酚類、萜烯、三萜類等化學(xué)成分具有抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等作用[2-6]。

一測多評法是利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只以一個(gè)對照品為參照物(對照品廉價(jià)、穩(wěn)定、易得)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分(對照品相對價(jià)高難得)的同步測定，這是一種中藥多成分同步質(zhì)量控制的新模式[7]。

黃酮類化合物作為番石榴葉的主要活性成分，現(xiàn)有番石榴葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并未對其黃酮類成分含量進(jìn)行測定，導(dǎo)致藥材質(zhì)量難以控制。雖然也文獻(xiàn)報(bào)道番石榴葉中多種黃酮類成分同時(shí)測定的方法[8，9]，但需要購買多個(gè)對照品，且操作繁瑣，在實(shí)際質(zhì)量控制中難以廣泛普及與應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過一測多評法(QAMS)同時(shí)測定番石榴葉中金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量，旨在為番石榴葉藥材質(zhì)量控制與評價(jià)提供新方法。

1 材料

1.1 儀器

1260AT 型高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)；HPLC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；BN3000 型萬分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；CP2000 型十萬分子一電子天平(德國 Sartorius 公司)；UPTUO-I-1000TE 優(yōu)普系列超純水機(jī)(成都純水科技有限公司)；SG8200HDT 型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

金絲桃苷(批號：wkq18111901)、異槲皮苷(批號：wkq18022308)、瑞諾苷(批號：PS000436)、番石榴苷(批號：wkq18111404)、萹蓄苷(批號：PS000159)、槲皮素(批號：wkq18030806)，純度均為HPLC≧98%，所有對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈(色譜純，美國TEDIA有限公司)；甲醇、無水乙醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

1.3 藥材

11批番石榴葉藥材購自成都通靈中藥飲片精選有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的葉，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～15 min，11%～13.5% A；15～30 min，13.5%～18% A；30～40 min，18% A；40～65 min，18%～49% A；65～70 min，49%～11% A)；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。

2.1.2 對照品溶液的制備

分別取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素濃度分別為1.172、1.121、1.093、1.102、1.188、1.154 mg/mL的對照品儲備溶液，依次精密吸取各對照品儲備溶液150、100、150、150、200、200 μL，置同一10 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過4號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減少質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別精密吸取上述混合對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察

取“2.1.2”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液1、3、7、10、15、20 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，取平均值。以對照品進(jìn)樣量(X) 為橫坐標(biāo)，峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見表 2)。

圖1 混合對照品(A)、番石榴葉樣品(B)及陰性對照(C)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC of reference substances(A),Psidium guajava sample(B) and negative control(C) 注：1.金絲桃苷；2.異槲皮苷；3 .瑞諾苷；4.番石榴苷；5.萹蓄苷；6.槲皮素。Note:1.Hyperoside;2.Isoquercitroside;3.Reynoutrin;4.Guaijaverin;5.Avicularin;6.Taxifolin.

表2 6種黃酮類成分線性關(guān)系考察

2.1.5 相對校正因子計(jì)算

以金絲桃苷為內(nèi)參物，精密吸取混合對照品溶液1、3、5、7、10、15、20 μL，進(jìn)行分析，記錄各成分峰面積，計(jì)算金絲桃苷對異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的相對校正因子，結(jié)果見表3。

表3 相對校正因子測定結(jié)果

續(xù)表3(Continued Tab.3)

進(jìn)樣量Sample volume(μL)f金絲桃苷/異槲皮素Hyperin/Isoq-uercitrosidef金絲桃苷/瑞諾苷Hyperin/Reynoutrinf金絲桃苷/番石榴苷Hyperin/Guaijaverinf金絲桃苷/萹蓄苷Hyperin/Avicularinf金絲桃苷/槲皮素Hyperin/Taxifolin150.937 90.865 30.859 40.899 90.609 8200.937 10.864 20.858 20.898 50.609 1平均值A(chǔ)verage0.937 20.865 10.858 60.899 60.611 4RSD(%)0.040.080.070.070.45

2.1.6 精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄各成分峰面積并計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為1.10%、1.13%、1.12%、1.12%、1.12%、1.10%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取Y1樣品按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.97% 、0.90%、0.79%、0.87%、0.82%、1.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.3”項(xiàng)中供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積并計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的峰面積RSD 值分別為0.26%、0.30%、0.41%、0.32%、0.35%、0.64%，表明供試品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知6種成分含量的番石榴葉供試品粉末約0.5 g，精密稱定，平行6份，加入各對照品儲備液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表4。計(jì)算得到金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的平均加樣回收率依次為102.34%、102.39%、101.05%、100.12%、101.11%、99.01%，RSD值依次為2.13%、1.11%、3.06%、3.32%、2.00%、3.44%，表明該方法加樣回收率良好。

表4 番石榴葉中6種黃酮類成分的加樣回收率(n=6)

續(xù)表4(Continued Tab.4)

化學(xué)成分Component取樣量Sample amout(g)樣品中量Sample content(mg)加入量Added (mg)測得量Measured (mg)回收率Recovery(%)平均回收率Average recovery(%)RSD(%)0.500 20.485 20.546 51.049 8103.310.505 20.490 00.546 51.061 1104.490.500 80.485 80.546 51.014 796.79番石榴苷Guaijaverin0.500 71.151 61.212 22.325 496.83100.123.320.504 41.160 11.212 22.332 296.690.500 61.151 41.212 22.412 0103.990.500 21.150 51.212 22.341 598.260.505 21.162 01.212 22.389 3101.250.500 81.151 81.212 22.408 7103.69萹蓄苷Avicularin0.500 71.301 81.425 62.787 6104.22101.112.000.504 41.311 41.425 62.768 9102.240.500 61.301 61.425 62.721 099.570.500 21.300 51.425 62.733 5100.510.505 21.313 51.425 62.761 5101.570.500 81.302 11.425 62.707 198.55槲皮素Taxifolin0.500 70.055 10.057 70.113 2100.7599.013.440.504 40.055 50.057 70.112 799.230.500 60.055 10.057 70.114 7103.420.500 20.055 00.057 70.112 8100.110.505 20.055 60.057 70.111 697.020.500 80.055 10.057 70.109 093.50

2.2 相對校正因子重現(xiàn)性考察

考察不同色譜系統(tǒng)(島津HPLC-20AT 型和兩臺Agilent 1260AT 型)及不同的色譜柱：Boston C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)對相對校正因子的影響，相對校正因子RSD<2.7% ，說明相對校正因子在不同色譜柱和儀器下的耐用性較好，結(jié)果見表5。

表5 不同色譜柱和儀器測得的相對校正因子

2.3 QAMS法對待測色譜峰的定位

通過相對保留時(shí)間對待測化合物進(jìn)行指認(rèn)。以金絲桃苷為參照，分別考察相對保留時(shí)間在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱中的重現(xiàn)性。各待測組分相對保留時(shí)間無明顯差異，RSD值均小于5%，可以用來進(jìn)行色譜峰的定位，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器及規(guī)格色譜柱下目標(biāo)成分的相對保留值

2.4 QAMS法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

取 11 批番石榴葉樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法測定樣品中金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量，再用建立的QAMS法對其進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，2種方法測得的番石榴葉中有效成分含量沒有顯著性差異，提示“一測多評”法應(yīng)用于番石榴葉的多成分質(zhì)量評價(jià)是可行的。結(jié)果見表7。

表7 外標(biāo)法與QAMS法測定番石榴葉中黃酮類成分含量的比較(n=3)

注:a:外標(biāo)法；b:QAMS。

Note:a:external standard method;b:quantitative analysis of multi-components by single marker.

3 討論

3.1 供試品制備條件考察

分別考察了不同提取方式(回流、超聲)、提取溶劑(純甲醇、70%甲醇、80%甲醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇)、溶劑用量(15、25、50 mL)、提取時(shí)間(30、40、50 min)對番石榴葉中金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的提取效率的影響，最終確定提取條件為以60%乙醇25 mL超聲提取30 min，6種黃酮類成分提取率較高，且色譜峰峰形較好，分離度較好。

3.2 流動(dòng)相及檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈分別與0.2%磷酸水、0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果和出峰時(shí)間，最終選擇乙腈-0.2%磷酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，得到的色譜圖中各色譜峰出峰時(shí)間適中，分離效果較好。參考紫外可見分光光度法，在 200～400 nm 下對 6種對照品進(jìn)行了掃描，結(jié)果表明在360 nm處各色譜峰分離效果好，且均有最大吸收，故選擇360 nm為檢測波長。本次實(shí)驗(yàn)中，流動(dòng)相條件對色譜峰峰形及分離度的影響大于提取方式和提取溶劑。

3.3 內(nèi)參物的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇金絲桃苷為內(nèi)參物，金絲桃苷價(jià)格低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定，且實(shí)驗(yàn)過程中長期放置后峰面積沒有明顯變化，因此選擇金絲桃苷對番石榴葉中5種黃酮類成分進(jìn)行測定。

3.4 測定結(jié)果分析

來自11個(gè)不同地區(qū)的番石榴葉飲片中金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量平均值分別為0.201%、0.229%、0.084%、0.226%、0.217%、0.015%。傅予[10]在乙醇體積分?jǐn)?shù)51.62%、乙醇用量25 mL、酶用量0.93%超聲提取33.67 min條件下測定的總黃酮含量為98.43 mg/g，即百分含量為0.984%。本次實(shí)驗(yàn)中，選擇60%乙醇25 mL超聲提取30 min測定得出番石榴葉中6種黃酮類成分總量的平均值為0.972%，與傅予的測定結(jié)果十分接近。因此可以初步判斷，本研究測定的6種成分為番石榴葉中的主要黃酮類物質(zhì)。不同地區(qū)的番石榴葉飲片中黃酮類成分含量存在較大差異。其中，云南地區(qū)的番石榴葉中瑞諾苷含量最高，平均值為0.090 1%。四川地區(qū)的番石榴葉中異槲皮苷、番石榴苷、萹蓄苷含量最高，平均值分別為0.258%、0.242%、0.258%。廣西地區(qū)的番石榴葉中金絲桃苷、槲皮素含量最高，平均值分別為0.238 1%、0.021 6%。槲皮素是番石榴葉中主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化[11]、抗菌、抗病毒，抗腹瀉等作用，因此可以初步判斷廣西地區(qū)的番石榴葉質(zhì)量較四川、云南、貴州地區(qū)好。本實(shí)驗(yàn)首次將QAMS法應(yīng)用于番石榴葉的質(zhì)量評價(jià)中，用該法測定了11批番石榴葉藥材中金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷、槲皮素的含量，與傳統(tǒng)外標(biāo)法所得含量之間沒有顯著性差異。證明該方法可靠性強(qiáng)，同時(shí)可節(jié)約成本，可以在缺少對照品的情況下，通過fk/s及色譜峰定位計(jì)算其量，實(shí)現(xiàn)番石榴葉中多種有效成分質(zhì)量控制。