中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性及成分分析

周連玉，鐘 松，朵紅梅，喬 楓

1青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2青海省第四人民醫(yī)院，西寧810008

禾草內(nèi)生真菌是指在禾草類植株內(nèi)生長(zhǎng)并完成全部或大部分生活周期，而不顯示外部癥狀的一類真菌[1]，許多研究表明了禾草內(nèi)生真菌能產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì)，如抗菌活性類[2]、除草活性類[3]等。因此，內(nèi)生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑。

許多研究者從不同植物體中分離出多種內(nèi)生真菌，以內(nèi)生真菌、內(nèi)生真菌培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)物的提取物進(jìn)行抑菌活性研究[4,5]，從真菌菌絲生長(zhǎng)[4]、菌絲形態(tài)[6]、孢子萌發(fā)[7]以及細(xì)菌生長(zhǎng)[8]和細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)[9]等方面證實(shí)了內(nèi)生真菌的生物防治效果。揮發(fā)性物質(zhì)主要包括揮發(fā)性生物堿、烴類、脂類、醇類、酸類、酯類、酮類、酚類和萜類物質(zhì)。內(nèi)生真菌代謝的揮發(fā)性成分發(fā)揮著溶栓活性[10]、抑菌活性[11]等多種功能。

中華羊茅(Festucasinensis)是一種內(nèi)生真菌侵染率高的多年生草本植物，具有適口性好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗寒、抗旱、發(fā)病率低等優(yōu)勢(shì)[12]。已有研究報(bào)道了中華羊茅內(nèi)生真菌菌株的生物學(xué)與生理學(xué)特性、生物活性、形態(tài)多樣性及分類學(xué)地位[13-17]。前期的研究工作發(fā)現(xiàn)采用平板對(duì)峙培養(yǎng)中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo?菌株對(duì)一些病原菌有抑制作用，在離體葉片上其代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物能控制植物病原菌的感病率和病情發(fā)展，并測(cè)定了乙酸乙酯粗提物的各組分含量，其中主要成分是一些揮發(fā)性物質(zhì)[15]。本研究以中華羊茅Epichlo?菌株為材料，先測(cè)定其揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯粗提物、水相部分和發(fā)酵液對(duì)真菌菌絲體生長(zhǎng)速率的作用；再進(jìn)一步探討其不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)以及細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)GC-MS技術(shù)分析其揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分；為開發(fā)利用新型熏蒸生物農(nóng)藥提供一定依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.菌株[15]、小麥根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)和新月彎孢(Curvularialunata)由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護(hù)所提供，黑曲霉(Aspergillusniger)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)購(gòu)于廣東微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：純化和活化菌株采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL)；液體種子培養(yǎng)基采用PDB(馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL)；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為山梨醇100.0 g，酵母膏 3.0 g，葡萄糖 40.0 g，色氨酸 0.8 g，谷氨酸 10.0 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH5.6；真菌孢子萌發(fā)采用水瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂15 g，蒸餾水 1 000 mL)。

細(xì)菌培養(yǎng)基：細(xì)菌固體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4)；細(xì)菌液體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4)。

1.2 方法

1.2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.培養(yǎng)

將3塊4 mm直徑的菌塊接種于種子培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，于25±1 ℃，130 rpm振蕩培養(yǎng)15天，所獲培養(yǎng)液作為液體菌種。將3 mL液體菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，25±1 ℃條件下130 rpm振蕩培養(yǎng)55 天。

1.2.2 粗提物的提取

每次取300 mL研磨的發(fā)酵產(chǎn)物在揮發(fā)油提取器中100 ℃條件下持續(xù)4 h蒸餾得到的揮發(fā)性物質(zhì)，然后用乙酸乙酯萃取發(fā)酵產(chǎn)物，分別得到乙酸乙酯部分及水相部分，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 ℃減壓濃縮至干，得到浸膏用于抑菌活性測(cè)定。

1.2.3 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯部分、水相部分、發(fā)酵液稀釋液對(duì)小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉4種真菌生長(zhǎng)的影響。首先用約2 mL二甲基亞砜將粗提物(乙酸乙酯粗提物或水相部分)0.15 g溶解，通過(guò)0.45 μm無(wú)菌濾膜定容至2 mL， 取400 μL至另一離心管，加1 200 μL二甲基亞砜，剩下1 600 μL，分別加至118.4 mL 50 ℃的無(wú)菌PDA培養(yǎng)基迅速混勻，再倒入12個(gè)9 cm平板中，即得粗提物濃度為250和1 000 μg/mL的培養(yǎng)基；對(duì)照為1 600 μL二甲基亞砜。揮發(fā)性物質(zhì)或發(fā)酵液原液1.5 mL用二甲基亞砜溶解，步驟同上，分別得到2.5、10 μL/mL。

將直徑4 mm真菌菌塊接種于培養(yǎng)皿中央，25±1 ℃培養(yǎng)，第4天測(cè)定菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)三次。計(jì)算公式如下：

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑-處

理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-接種時(shí)菌塊直徑)]

×100%

1.2.4 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌孢子萌發(fā)和芽管長(zhǎng)度的抑制效果

真菌接種于PDA，25±1 ℃培養(yǎng)7天后，將每個(gè)供試病原菌的培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL無(wú)菌水，用解剖針輕輕攪拌以洗脫孢子，用兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾，血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)孢子濃度，制備106cfu/mL孢子懸浮液。

采用懸滴法研究對(duì)真菌孢子萌發(fā)抑制作用，用無(wú)菌水稀釋揮發(fā)性物質(zhì)，得到不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)(1.25、2.5、5、10、20、40 μL/mL)，不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)與孢子懸浮液等量混合，混勻后吸取20 μL混合液滴加到水瓊脂上(水瓊脂事先滴在玻片上)，對(duì)照用孢子懸浮液與等量無(wú)菌水混合。每個(gè)處理重復(fù)三次。待干后放在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中將玻片倒置，于25 ℃保濕培養(yǎng)8 h，觀察并計(jì)錄視野中總孢子數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)，芽管長(zhǎng)度用帶有測(cè)微尺的顯微鏡校正后測(cè)量。

孢子萌發(fā)抑制率(%)=[(對(duì)照孢子萌發(fā)率-

處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā)率]×100%

芽管長(zhǎng)度抑制率(%)=[(對(duì)照芽管長(zhǎng)度-

處理芽管長(zhǎng)度)/對(duì)照芽管長(zhǎng)度]× 100%

1.2.5 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的抑制效果

分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，采用血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)細(xì)菌濃度，制備106cfu/mL細(xì)菌懸浮液。

采用濾紙片擴(kuò)散法(濾紙片直徑15 mm)測(cè)定不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)1.25、2.5、5、10、20、40 μL/mL對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌作用。在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入適量牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，鋪平凝固作為底層；將供試菌懸液與冷卻至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基以1∶9混合均勻，傾注到冷卻牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面的培養(yǎng)皿中。將無(wú)菌的濾紙片放入平板中央，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，吸取不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)20 μL滴在滅菌的濾紙片，將處理好的平板置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察濾紙片周圍抑菌圈的大小，并測(cè)量其直徑。每個(gè)處理重復(fù)三次。

1.2.6 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)成分測(cè)定

利用頂空固相微萃取對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取，用Agilent 7890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-Wax毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA)分析鑒定其各成分。將一定量的揮發(fā)性物質(zhì)置于固相微萃取儀采樣瓶中，于60 ℃萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入240 ℃ GC-MS進(jìn)樣口解吸4 min。

柱溫40 ℃保留2 min，以5 ℃/min 升溫至240 ℃，保持5 min；前進(jìn)樣口溫度240 ℃；傳輸線溫度240 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)；載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍33～500 amu。

對(duì)總離子流圖的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)，確定各組揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法計(jì)算各個(gè)組分的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各項(xiàng)指標(biāo)釆用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(LSD，P<0.05)。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的線性回歸方程計(jì)算真菌孢子萌發(fā)IC50半致死濃度和IC90極限濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)四種真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯部分、水相部分、發(fā)酵液稀釋液對(duì)小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉4種真菌菌絲生長(zhǎng)的影響。從表1可見，4種粗提物對(duì)總狀毛霉無(wú)抑制作用，對(duì)其他三種真菌均起到一定的抑制效果，且10 μL/mL濃度的揮發(fā)性物質(zhì)抑制效果顯著高于其他成分，其次是濃度為1 000 μg/mL的乙酸乙酯提取部分。由此可見，中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性主要存在揮發(fā)性物質(zhì)和乙酸乙酯部分，且揮發(fā)性物質(zhì)效果優(yōu)于乙酸乙酯部分。

表1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)4種真菌菌絲生長(zhǎng)的作用

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，小寫字母表示在0.05水平上不同提取物對(duì)同一真菌抑制率差異顯著性(P<0.05)。

Note:Values are means ± standard deviation (SD).Different lower case letters indicate a significant effect of different concentrations of crude extracts on radial growth of the tested fungus (P<0.05).

2.2 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌孢子萌發(fā)和芽管長(zhǎng)度的抑制效果

2.2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌孢子萌發(fā)的抑制效果

采用懸滴法顯微觀察不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)1.25、2.5、5、10、20、40 μL/mL對(duì)小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉4種真菌孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度的作用。不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)均對(duì)4種真菌孢子萌發(fā)有一定的抑制作用(表2)，隨著濃度增加抑制孢子萌發(fā)率的效果增強(qiáng)，對(duì)同一真菌孢子萌發(fā)抑制率各濃度之間存在顯著性差異(P<0.05)，40 μL/mL揮發(fā)性物質(zhì)抑制效果顯著高于其他各濃度(P<0.05)。揮發(fā)性物質(zhì)濃度1.25～2.5 μL/mL對(duì)四種真菌孢子萌發(fā)抑制率大小依次為總狀毛霉>新月彎孢>小麥根腐離蠕孢>黑曲霉，濃度在5～40 μL/mL范圍內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)抑制真菌孢子萌發(fā)率為總狀毛霉>小麥根腐離蠕孢>新月彎孢>黑曲霉。由真菌孢子萌發(fā)抑制率線性回歸方程計(jì)算IC50半致死濃度和IC90極限濃度(表2)，對(duì)4種真菌孢子半致死濃度依次為總狀毛霉<小麥根腐離蠕孢<新月彎孢<黑曲霉。不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌孢子萌發(fā)在一定程度上均有抑制作用，就不同真菌而言，半致死濃度有差異，這就表明了針對(duì)不同真菌引起的病害應(yīng)選擇合適的揮發(fā)性物質(zhì)劑量。

表2 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌孢子萌發(fā)率的抑制作用與孢子萌發(fā)抑制率IC50 和IC90值

續(xù)表2(Continued Tab.2)

揮發(fā)性物質(zhì)濃度Volatile substance (μL/mL) 小麥根腐離蠕孢B.sorokiniana新月彎孢C.lunata黑曲霉A.niger總狀毛霉M.racemosus孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)2.571.45±1.86b10.69±2.33d38.57±0.93c17.20±2.00d46.74±0.83c9.44±1.61d52.21±2.71c32.98±3.48d553.98±1.84c32.52±2.31c35.02±0.75d24.80±1.62c45.56±0.98cd11.72±1.90cd48.19±1.34d38.14±1.72d1051.22±1.07c35.97±1.34c33.97±0.06d27.07±0.13c44.27±0.04d14.24±0.07c42.22±2.07e45.81±2.66c2046.15±1.78d42.31±2.23b31.62±1.44e32.10±3.08b39.17±1.72e24.10±3.32b32.11±0.27f58.78±0.34b4036.67±3.06e54.17±3.82a26.61±1.73f42.87±3.72a34.27±0.56f33.60±1.09a22.16±0.30g71.55±0.39a抑制率IC50 IC50value(μL/mL)-27.49-89.41-120.53-10.10抑制率IC90IC90 value(μL/mL)-674.70-14 520.00-3 605.00-551.77

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，小寫字母表示在同一列中各處理間在0.05水平上存在差異顯著性。

Note:Values are means±standard deviation (SD).Non-matching small letters at the same column indicate a significant difference among treatments (P<0.05).

2.2.2 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)油對(duì)芽管長(zhǎng)度的抑制效果

所供試的6種揮發(fā)性物質(zhì)濃度對(duì)4種真菌芽管生長(zhǎng)有一定的抑制效果(表3)，高濃度抑制效果顯著高于低濃度(P<0.05)。1.25 μL/mL和20～40 μL/mL揮發(fā)性物質(zhì)抑制4種真菌芽管長(zhǎng)度表現(xiàn)為小麥根腐離蠕孢>黑曲霉>新月彎孢>總狀毛霉，揮發(fā)性物質(zhì)濃度為2.5 μL/mL的抑制大小為黑曲霉>總狀毛霉>小麥根腐離蠕孢>新月彎孢，5～10 μL/mL揮發(fā)性物質(zhì)抑制芽管生長(zhǎng)的效果從大到小為小麥根腐離蠕孢>黑曲霉>總狀毛霉>新月彎孢。不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌芽管生長(zhǎng)在一定程度上均起抑制作用，就不同真菌而言，表明了針對(duì)不同真菌引起的病害應(yīng)選擇合適的揮發(fā)性物質(zhì)劑量。

表3 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)4種真菌孢子芽管長(zhǎng)度的抑制作用

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，小寫字母表示在同一列中各處理間在0.05水平上存在差異顯著性。

Note:Values are means±standard deviation (SD).Non-matching small letters at the same column indicate a significant difference among treatments (P<0.05).

2.3 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的抑制效果

從表4可見，所測(cè)試揮發(fā)性物質(zhì)隨著濃度的增加對(duì)供試細(xì)菌菌株的抑菌圈直徑增加，同一濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是常見食源性疾病的病原菌，而本試驗(yàn)的結(jié)果表明了中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)可抑制這兩種細(xì)菌。

表4 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑(cm)

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，小寫字母表示在0.05水平上不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)同一細(xì)菌抑菌圈差異顯著性(P<0.05)。

Note:Values are means ± standard deviation(SD).Different lower case letters indicate a significant effect of different concentrations of volatile substance on inhibition zones of the tested bacterium (P<0.05).

2.4 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分

從中華羊茅內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)中共檢測(cè)出400個(gè)峰(圖1)，以匹配度大于90%為標(biāo)準(zhǔn)鑒定出 32 種化合物，占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的43.54%，并通過(guò)峰面積歸一化法確定各成分的相對(duì)百分含量(表5)。中華羊茅內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)的組分復(fù)雜多樣， 以烴類6種、酯類5種、 醛類5種、醇類4種、酮類4種和吡啶類4種化合物為主。 相對(duì)含量較高的有異山梨醇(16.26%)、甲基叔丁基醚(8.18%)、二氫甘露醇(3.75%)、羥基丙酮(2.99%)、乙酸(1.22%)、己醇(1.20%)、3-糠醛(0.92%)、5-羥甲基二氫呋喃-2酮(0.86%)、5-羥基戊酸-2,4-二叔丁基苯酯(0.86%)和棕櫚酸甲酯(0.85%)，還有兩種相對(duì)含量超過(guò)10%的不確定化合物。

圖1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.菌株揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the volatile substance of Epichlo? sp.from F.sinensis by GC-MS

表5 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.菌株揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)成分GC-MS分析

續(xù)表5(Continued Tab.5)

編號(hào)No.保留時(shí)間Retention time (min)化合物Compound分子式Molecular formula相對(duì)含量Relative content (%)55.20癸烯 1-DeceneC10H200.5366.15十一烷 UndecaneC11H240.2077.92間二甲苯 Benzene,1,3-dimethyl-C8H100.0889.813-辛酮 3-OctanoneC8H16O0.79910.442,6-二甲基吡啶 2,6-LutidineC7H9N0.521011.674-甲基吡啶 Pyridine,4-methyl-C6H7N0.491111.81羥基丙酮 2-Propanone,1-hydroxy-C3H6O22.991212.87己醇 1-HexanolC6H14O1.201313.092,3-二甲基吡啶 Pyridine,2,3-dimethyl-C7H9N0.421413.39壬醛 NonanalC9H18O0.121515.433-糠醛 3-FuraldehydeC5H4O20.921615.51乙酸 Acetic acidC2H4O21.221715.833,5-二甲基吡啶 Pyridine,3,5-dimethyl-C7H9N0.421816.462-乙?；秽?Ethanone,1-(2-furanyl)-C6H6O20.571917.07反式-2-壬醛 2-Nonenal,(E)-C9H16O0.212018.085-甲基呋喃醛 2-Furancarboxaldehyde,5-methyl-C6H6O20.202118.53十六烷 HexadecaneC16H340.092225.931,4-丁二醇 1,4-ButanediolC4H10O20.082327.51羥基苯磷酸 Phosphonic acid,(p-hydroxyphenyl)-C6H7O4P0.112428.172-吡咯烷酮 2-PyrrolidinoneC4H7NO0.642531.53棕櫚酸甲酯 Hexadecanoic acid,methyl esterC17H34O20.852631.94二氫甘露醇 DianhydromannitolC6H10O43.752733.225-羥基戊酸-2,4-二叔丁基苯酯 Pentanoic acid,5-hydroxy-,2,4-di-t-butylphenyl estersC19H30O30.862835.13硬脂酸甲酯 Methyl stearateC19H38O20.192935.955-羥甲基二氫呋喃-2-酮 5-Hydroxymethyldihydrofuran-2-oneC5H8O30.863036.325-羥甲基糠醛 5-HydroxymethylfurfuralC6H6O30.253137.011,2-苯二甲酸二(2-甲基-丙基)酯 1,2-Benzenedicarboxylic acid,bis(2-methylpropyl) esterC16H22O40.063237.90異山梨醇 IsosorbideC6H10O416.263322.56不確定化合物11.723410.72不確定化合物10.97

3 結(jié)論

在離體培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物成分較為復(fù)雜，能抑制多種真菌的菌絲生長(zhǎng)。周生亮等[4]從薯蕷根莖和種子中分離出6株內(nèi)生真菌菌株，利用生長(zhǎng)速度法測(cè)定出6株菌株的發(fā)酵液對(duì)6種植物病原真菌有一定的抑菌效果，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。分別用甲醇、乙酸乙酯和石油醚萃取冬青衛(wèi)矛內(nèi)生真菌2QR1菌株菌絲體以及乙酸乙酯萃取發(fā)酵液得到各部分粗提物，在500 μg/mL濃度下發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對(duì)供試病原真菌抑菌活性最大，而菌絲體甲醇提取物和菌絲體石油醚提取物對(duì)個(gè)別供試病原真菌菌絲生長(zhǎng)有較弱的抑制作用[5]。此外，Yue等[18]發(fā)現(xiàn)無(wú)性型(Neotyphodiumtembladerae)和羊茅香燭菌(Epichlo?festucae)液體培養(yǎng)物的粗提物對(duì)病原菌Cryphonectriaparasitica具有很高的抑菌活性。本研究中以中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯粗提物、水相部分和發(fā)酵液稀釋液對(duì)小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉菌絲生長(zhǎng)的作用(表1)，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)和乙酸乙酯粗提物抑菌活性較好，而對(duì)個(gè)別供試真菌無(wú)抑制作用，揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌作用方式還需從多方面進(jìn)行試驗(yàn)。

一些研究者從菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)動(dòng)態(tài)方面研究?jī)?nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果[6,7]。采用孢子萌發(fā)法研究黑麥草4株內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對(duì)4種植物病原菌孢子萌發(fā)和芽管的作用，證實(shí)了內(nèi)生真菌發(fā)酵液均有明顯的抑制效果，且對(duì)小麥根腐離蠕孢抑制作用最大[7]。Holzmann-Wirth等[19]用不同的有機(jī)溶劑對(duì)草地羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)物和瓊脂培養(yǎng)基上的菌絲體進(jìn)行萃取，發(fā)現(xiàn)甲醇和水提取物對(duì)大刀鐮孢的孢子具有明顯的抑制或延遲萌發(fā)的作用。而本試驗(yàn)以中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.不同濃度揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉孢子萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度的作用(表2，3)，結(jié)果表明揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)不同菌種的抑制作用具有差異性，且對(duì)總狀毛霉抑制效果最大，隨著揮發(fā)性物質(zhì)的濃度增加其抑制孢子萌發(fā)率的效果越好；揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)四種供試真菌芽管生長(zhǎng)有一定的抑制效果，且高濃度抑制效果顯著高于低濃度。由此可見，內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)孢子萌發(fā)和芽管長(zhǎng)度有抑制作用，就揮發(fā)性物質(zhì)而言，針對(duì)不同真菌引起的病害應(yīng)選擇合適的揮發(fā)性物質(zhì)劑量。

內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)某些真菌和細(xì)菌均有一定的抑菌效果。采用水蒸氣蒸餾法獲得尖瓣海蓮葉內(nèi)生真菌Penicilliumsp.B21揮發(fā)性物質(zhì)，以揮發(fā)性物質(zhì)的10和20 mg/L濃度處理，在20 mg/L時(shí)對(duì)大腸埃希氏菌和白色葡球菌有較好的抑菌效果[20]。解修超等[21]采用索氏提取法提取三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26的揮發(fā)性物質(zhì)，用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制作用，濃度為1 000.0 mg/mL時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性較高，而對(duì)枯草芽孢桿菌和白色念珠菌抑制作用較弱。本試驗(yàn)以濾紙片法測(cè)得不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑的作用(表4)，在40 μL/mL時(shí)抑菌圈直徑顯著大于對(duì)照(P<0.05)。從這些研究中發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)生真菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)細(xì)菌或真菌的抑制效果因菌種不同而異，可能是揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量存在差異性。

通常利用GC-MS技術(shù)測(cè)定內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)的組分種類和相對(duì)含量。三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)性物質(zhì)主要為油酸、棕櫚酸和油酸乙酯等化合物[21]，尖瓣海蓮葉內(nèi)生真菌Penicilliumsp.B21揮發(fā)性物質(zhì)主要為棕櫚酸、丁基-異丁基-鄰苯酸二甲酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯和硬脂酸[20]，菠蘿內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)主要為2-甲基-丙酸甲酯、2-甲基丙酸、3-甲基丁醇、乙酸異戊酯、2-甲基丙酸-2-甲基丁酯和乙醇[22]。由此可見，不同內(nèi)生真菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)組分和含量均存在一定的差異性。本試驗(yàn)的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)固相微萃取-氣相質(zhì)譜分析后，發(fā)現(xiàn)色譜峰數(shù)量較多(圖1)，而以匹配度高的質(zhì)譜峰為標(biāo)準(zhǔn)僅鑒定出32種組分，占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的43.54%，其中與抑菌活性的相關(guān)的化合物有乙酸、1,4-丁二醇、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯等物質(zhì)[22-24]。異山梨醇是一種滲透性口服脫水利尿藥，可作為聚合物改性及可降解聚合物制造的生物原料[25]；甲基叔丁基醚可應(yīng)用于清潔汽油辛烷值改進(jìn)劑[26]；還有二種組分含量超過(guò)10%的不能通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定(表5)，這些匹配度較低的化合物有待進(jìn)一步分離、鑒定。

總體上，目前的研究主要采用乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇和石油醚等有機(jī)溶劑萃取內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物，研究其對(duì)孢子萌發(fā)率、芽管長(zhǎng)度、菌絲生長(zhǎng)、菌絲形態(tài)和細(xì)菌等方面的作用，涉及內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)部分對(duì)上述測(cè)定指標(biāo)的研究還不多。而本試驗(yàn)從多個(gè)角度測(cè)定了中華羊茅內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)微生物的作用，可為開發(fā)新的生物制劑提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。