熱滅活副干酪乳桿菌Lc19對(duì)小鼠便秘的緩解作用研究

陳建國，李周勇，李桂花，周曉娟，桑躍，俞偉祖

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廊坊 065201）

隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及精神和社會(huì)壓力的增大，便秘已成為困擾現(xiàn)代人健康的主要問題之一，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。最近的調(diào)查顯示，在亞洲，便秘的發(fā)病率為9.6%，在歐美國家，便秘的發(fā)病率為8.1%[1]。在我國，便秘的發(fā)病率為5%～16%[2,3]。便秘的原因大多數(shù)為飲食不正常，通過改變飲食結(jié)構(gòu)來緩解便秘是一種安全又有效的方法。

研究表明，通過口服活的益生菌，對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行平衡和調(diào)節(jié)，可帶來顯著的通便效果，這已成為近年來健康治療功能性便秘大量采用的方法[4,5]。但是對(duì)于熱滅活的益生菌是否也能緩解便秘，國內(nèi)外文獻(xiàn)還鮮有報(bào)道。Takii等[6]研究了泡菜中活的和死的植物乳桿菌對(duì)于便秘人群的作用，結(jié)果表明兩種菌都可以緩解便秘。Katayama等[7]研究表明，熱滅活的副干酪乳桿菌可以緩解人群的便秘。益生菌緩解人群的便秘具有一定的菌株特異性，副干酪乳桿菌Lc19 (Lactobacillus para casei Lc19)是一株從長壽老人糞便中分離得到的益生菌株。本研究的目的是通過建立便秘小鼠模型評(píng)價(jià)活的與熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19的潤腸通便功能，為益生菌乳飲料的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/c雄性小鼠，6～8周齡，體重18～22g，SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。副干酪乳桿菌Lc19，由蒙牛乳業(yè)集團(tuán)基礎(chǔ)科學(xué)部菌種中心提供。

復(fù)方地芬諾酯片（批號(hào)1109026），為常州康普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；活性炭粉，為鞏義市嵩山濾材活性炭廠產(chǎn)品；阿拉伯樹膠，為廣東汕頭市西隴化工廠產(chǎn)品；MRS培養(yǎng)基，為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZDX35BI高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DNP9082恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；3K30型低溫高速離心機(jī)、ACCULAB分析天平（德國Satorious公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

活菌菌懸液的配制：將副干酪乳桿菌Lc19菌株用MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h，4500r/min離心15min，菌體沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中，用生理鹽水配制不同濃度的菌懸液。

熱滅活Lc19菌懸液的配制：將副干酪乳桿菌Lc19用MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h，121℃、15min滅菌，然后4500r/min離心15min，菌體沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中，用生理鹽水配制不同濃度的菌懸液。

墨汁的配制：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，稱取活性碳 (粉狀) 50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

復(fù)方地芬諾酯混懸液(0.05 g/100 m L及0.025g/100mL)的配制：分別取復(fù)方地芬諾酯片（每片含復(fù)方地芬諾酯2.5mg）20片、10片，用研缽研碎呈粉末后加水至50mL。臨用前配制。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)小鼠分為死菌組、活菌組、空白組和模型組。死菌與活菌組分別設(shè)置高低兩個(gè)劑量組，分別灌胃4×109、4×1010CFU/mL的Lc19菌懸液0.1mL/（kg·d）（以體重計(jì)，下同），空白組和模型組小鼠灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的生理鹽水0.1mL/（kg·d）；每天一次，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食，記錄各組小鼠體重變化。

1.3.3 小鼠排便實(shí)驗(yàn)

給受試樣品7d后，各組小鼠禁食不禁水16h。模型組、死菌組與活菌組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（10mg/kg），空白組給予生理鹽水。8×109、8×1010CFU/mL的Lc19死菌的菌懸液和8×109、8×1010CFU/mL的Lc19活菌的菌懸液，均與墨汁等體積混合，給予復(fù)方地芬諾酯0.5h后，空白組和模型組小鼠灌胃墨汁0.1mL/kg，益生菌Lc19活菌組與死菌組給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg，動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食。從灌胃墨汁開始，記錄每只動(dòng)物首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量。收集的糞便在105℃烘干至恒重，按式(1)計(jì)算糞便含水率。

1.3.4 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

給受試樣品15d后，各組小鼠禁食不禁水16h。模型組、死菌組與活菌組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（5mg/kg），空白組給予生理鹽水。給復(fù)方地芬諾酯0.5h后，Lc19活菌組與死菌組分別給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg（樣品劑量同1.3.3小鼠排便實(shí)驗(yàn)），對(duì)照組灌胃墨汁0.1mL/kg。25min后立即脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲腸部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長度”。按式(2)計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

墨汁推進(jìn)率需進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換， ，式中：A為墨汁推進(jìn)率，結(jié)果用小數(shù)表示。在進(jìn)行方差分析時(shí)，先使用方差分析程序做方差齊性檢驗(yàn)，方差齊后，計(jì)算F值，F(xiàn)＜0.05，則各實(shí)驗(yàn)組平均數(shù)間不存在顯著性差異，若F≥0.05、P≤0.05，表明各組均數(shù)之間存在顯著性差異；用一個(gè)對(duì)照組同每個(gè)實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體重變化

表2 Lc19對(duì)便秘模型小鼠各排便指標(biāo)的影響 (n＝10)

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化 (n＝10)

由表1可知，試驗(yàn)期間小鼠的體重在各劑量試驗(yàn)組與空白組間比較，均不存在顯著性差異（P＞0.05），表明試驗(yàn)過程中副干酪乳桿菌Lc19對(duì)雄性小鼠的體重沒有顯著性影響，本研究是在小鼠生理常態(tài)條件下進(jìn)行的。

2.2 小鼠排便實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)小鼠每天一次經(jīng)口灌胃副干酪乳桿菌Lc19的活菌體與死菌體，連續(xù)7d后測定對(duì)便秘模型小鼠首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量及糞便含水率的影響，結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組小鼠首次排黑便時(shí)間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、排便質(zhì)量和糞便含水率均有極顯著性差異（P＜0.01），說明便秘小鼠模型成立。

由表2可知，Lc19的活菌體與死菌體經(jīng)口灌胃7d后，對(duì)于首次排黑便時(shí)間，活菌組、死菌組與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），活菌組低于死菌組；對(duì)于5h內(nèi)黑便質(zhì)量，活菌組與死菌高劑量組與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），死菌低劑量組與模型組具有顯著差異（P＜0.05），活菌組高于死菌組；對(duì)于5h內(nèi)黑便粒數(shù)，活菌組、死菌組與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），活菌組高于死菌組；對(duì)于糞便含水率，活菌組、死菌組與模型組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小腸運(yùn)動(dòng)有3種方式，即張力收縮、分節(jié)運(yùn)動(dòng)和蠕動(dòng)，主要以蠕動(dòng)力推動(dòng)腸內(nèi)容物運(yùn)動(dòng)為主要方式[10]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)口灌胃給予小鼠止瀉劑復(fù)方地芬諾酯是一種便秘模型造模常用藥物[11]，其作用主要是直接作用于腸道平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器，消除局部腸黏膜蠕動(dòng)反射而使腸道蠕動(dòng)減慢，使腸內(nèi)容物通過延遲，致使小鼠排便困難，與便秘臨床癥狀相近。經(jīng)灌胃建立小鼠小腸蠕動(dòng)抑制模型后，再通過墨汁標(biāo)記觀察Lc19活菌體與死菌體對(duì)便秘小鼠腸道蠕動(dòng)的影響。實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃副干酪乳桿菌Lc19的活菌體與死菌體15d后，進(jìn)行小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 Lc19對(duì)便秘小鼠小腸墨汁推進(jìn)率的影響 (n＝10)

由表3可知，模型組墨汁推進(jìn)率明顯低于空白組（P＜0.01），墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)小鼠便秘模型造模成功。灌胃15d后，活菌組、死菌高劑量組小腸推進(jìn)率與模型組相比，極顯著增加（P＜0.01），死菌低劑量組顯著增加（P＜0.05），且出現(xiàn)劑量效應(yīng)，隨菌濃度的提高，便秘小鼠的墨汁推進(jìn)率增加。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過灌胃復(fù)方地芬諾酯建立小鼠的便秘模型，以小鼠的首次排便時(shí)間、排便粒數(shù)和質(zhì)量、糞便水分含量和墨汁推進(jìn)率等指標(biāo)評(píng)價(jià)活的與熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19對(duì)便秘模型小鼠的通便功能。綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，Lc19的活菌體與死菌體都可以改善便秘模型小鼠的排便能力?；罹w與死菌體相比可以顯著改善便秘模型小鼠的排便能力，活菌組與死菌組改善便秘的能力均存在劑量效應(yīng)，活菌高劑量組改善便秘的能力大于低劑量組，死菌高劑量組改善小鼠便秘的能力大于低劑量組。