甘蔗梢腐病輪枝鐮刀菌侵染甘蔗葉片的顯微觀察

劉丹丹 ，姚姿婷 ，賴小群 ，姚瀟 ，張木清 ，4，鄒承武 ，4，陳保善 ，4

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧530004；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧530004；3.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530004；4.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧530004)

0 引言

甘蔗梢腐?。⊿ugarcane pokkah boeng disease）是一種世界性甘蔗重要病害[1]。病害最初表現(xiàn)為心葉褪綠、變黃，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致甘蔗梢部幼嫩心葉壞死、腐爛，病株節(jié)間短小甚至整株枯萎死亡[2]。近年來，此病在我國(guó)主要蔗區(qū)呈明顯上升趨勢(shì)，尤其是在高溫高濕及施用氮肥過多的情況下發(fā)病嚴(yán)重，導(dǎo)致蔗莖產(chǎn)量和蔗糖分顯著下降[3-4]。

甘蔗梢腐病可由多種鐮刀菌引起，如輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides，簡(jiǎn)稱Fv）[5-6]、藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi，簡(jiǎn)稱Ff）、甘蔗鐮刀菌（F.sacchari，簡(jiǎn)稱Fs）和層出鐮刀菌（F.proliferatum，簡(jiǎn)稱Fp）[7-8]。我國(guó)主要甘蔗產(chǎn)區(qū)的梢腐病主要由Fv引起[9]。甘蔗梢腐病菌的人工接種通常是將病菌分生孢子懸浮液注射入甘蔗嫩梢或通過噴霧將分生孢子懸浮液接種到甘蔗葉片上[10]。前人對(duì)禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、Fp和Fv侵染玉米葉片的顯微觀察表明，病菌可從氣孔和葉片表面的毛狀體侵入[11-12]，但病原鐮刀菌入侵甘蔗的顯微過程尚未有報(bào)道。由于甘蔗梢腐病屬土傳和氣傳性病害，解析其侵染過程對(duì)于抗病品種選育和田間病害防控，均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料與菌株：供試甘蔗品種為廣西大學(xué)培育的‘中蔗9號(hào)’[13]，該品種在高氮栽培條件下高感甘蔗梢腐病。供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的輪枝鐮刀菌CNO-1菌株[9]。

試驗(yàn)試劑：乳酚油，水合氯醛，冰乙酸，苯胺藍(lán)，無水乙醇，均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純或分析純等級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分生孢子懸浮液的制備

將CNO-1菌株接種到PDA培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)7 d，加入無菌水，用涂布棒刮取菌絲后用2層無菌紗布過濾，在顯微鏡下對(duì)濾液中的分生孢子計(jì)數(shù)，并將濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL。

1.2.2 甘蔗幼苗培養(yǎng)

取中蔗9號(hào)半年蔗，切為單芽段，置于30℃恒溫箱中濕潤(rùn)催芽。待蔗芽長(zhǎng)出3片葉片，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗種植在育苗基質(zhì)（南寧桂裕鑫農(nóng)業(yè)科技有限公司）中。當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至5葉期時(shí)即可用于接種實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 接種方法

離體噴霧接種：在培養(yǎng)皿中放置由無菌水濕潤(rùn)的低速濾紙。將長(zhǎng)勢(shì)一致的5葉期甘蔗的正一葉剪成6 cm長(zhǎng)的葉段置于培養(yǎng)皿上。用噴壺將分生孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL）噴霧接種于葉片表面，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。在接種0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h和96 h取出葉片，用消毒的剪刀將葉片兩端剪去2 cm，剩余葉片剪成0.5 cm×2 cm的條形葉段用于染色觀察。

注射接種：參考Wang等接種方法[14]，用1 mL的注射器將100μL孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL）接種至長(zhǎng)勢(shì)一致的5葉期甘蔗幼苗的生長(zhǎng)點(diǎn)附近。在接種后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h分別對(duì)每株接種點(diǎn)下部葉鞘位置進(jìn)行取樣，并剪成0.5 cm×2 cm的條形待染色。

1.2.4 苯胺藍(lán)染色及顯微觀察

先將甘蔗葉片透明化處理[15]，簡(jiǎn)要步驟如下：（1）將剪好的條形甘蔗葉片放在玻璃試管中，加入乳酚油/無水乙醇（體積比1∶1）的混合液至淹沒葉片1 cm，置于水浴鍋中煮沸5～10 min（通風(fēng)櫥中操作），然后塞上試管塞于室溫下放置過夜；（2）將放置過夜的葉段放入飽和水合氯醛液中（在250 g水合氯醛中加入100 mL無菌水使其融化），使飽和水合氯醛淹沒葉段，室溫放置3 d，期間根據(jù)液體顏色的深淺適時(shí)更換水合氯醛，即水合氯醛顏色變深時(shí)及時(shí)更換；（3）將上述葉段置于95%乙醇/冰乙酸（體積比為1∶1）混合液中煮沸脫色15 min，將脫色的葉段再次置于飽和水合氯醛中透明化處理一段時(shí)間，直至水合氯醛無色透明，經(jīng)過透明化處理的葉段置于50%的甘油中暫存以備鏡檢。

葉片經(jīng)透明化處理后，使用0.1%苯胺藍(lán)（在0.1 g苯胺藍(lán)中加入100 mL無水乙醇）于室溫染色5 min，無菌水沖洗3次，置于OLYMPUSTMBX51光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧接種的侵染過程

將孢子懸浮液噴霧接種到離體甘蔗葉片上12 h，葉片的兩端開始出現(xiàn)褐色；24～72 h，褐色逐漸向中間延伸且顏色逐漸加深；96 h，整張葉片均變?yōu)楹稚秩静课坏募?xì)胞死亡（圖1 A）。對(duì)葉片進(jìn)行苯胺藍(lán)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)自接種12 h起，在甘蔗葉片表面的氣孔和不同類型的毛狀體[12]（trichomes）處，包括刺毛[16]（prickle trichomes）和雙細(xì)胞毛狀體（bi-cellular trichomes），以及葉片邊緣呈“倒刺”形狀的剛毛[17]（macro trichomes），均能觀察到小型分生孢子附著。24 h，觀察到孢子膨大萌發(fā)；48 h，孢子生長(zhǎng)出菌絲，有些菌絲的前端進(jìn)入氣孔，有些菌絲纏繞在毛狀體上或已進(jìn)入毛狀體，有些沿葉片邊緣的剛毛延伸，但似乎并未進(jìn)入剛毛內(nèi)；72 h，菌絲繼續(xù)向毛狀體內(nèi)延伸（圖1 B）。

圖1輪枝鐮刀菌分生孢子經(jīng)噴霧接種離體甘蔗葉片的萌發(fā)及侵染過程Fig.1 Germination and infection of sugarcane leaves in vitro by spray inoculation with conidia of Fusarium verticillioides

2.2 注射接種的侵染過程

將孢子懸浮液注射接種至5葉期甘蔗苗的生長(zhǎng)點(diǎn)附近，24 h后接種點(diǎn)處出現(xiàn)淡褐色菌斑，48 h在接種點(diǎn)處和接種點(diǎn)下方幼嫩組織出現(xiàn)褐色菌斑，72 h褐色菌斑顏色更深（圖2A）。不同時(shí)間點(diǎn)取發(fā)病部位用苯胺藍(lán)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。接種12 h，觀察到小型分生孢子附著于氣孔表面且在氣孔張開處開始膨大，部分孢子附著于毛狀體上且開始膨大；24～36 h，分生孢子長(zhǎng)出芽管，伸向氣孔內(nèi)或毛狀體內(nèi)；48 h，芽管長(zhǎng)成菌絲，有菌絲出現(xiàn)分枝，菌絲繼續(xù)進(jìn)入氣孔內(nèi)及毛狀體內(nèi)；72 h，菌絲生長(zhǎng)加快，呈放射狀從氣孔內(nèi)部伸出以及菌絲纏繞在毛狀體周圍，并繼續(xù)向周圍組織延伸，包括纏繞及入侵表面刺毛（圖2 B、C）。

圖2 Fv分生孢子注射接種甘蔗幼苗的侵染過程Fig.2 Infection process on sugarcane seedlings by injection with conidia of Fv

3 討論

鐮刀菌侵染玉米時(shí)，可發(fā)生系統(tǒng)或局部侵染[1,18]，從根部進(jìn)入侵染可導(dǎo)致系統(tǒng)性侵染，病菌菌絲從根進(jìn)入到莖，最后延伸至玉米穗，受侵染的玉米?？梢鸲吻秩綶19]，而通過玉米絲的局部侵染可加劇對(duì)玉米粒的侵染[20]。鐮刀菌還可通過在葉片的表皮細(xì)胞、氣孔及毛狀體進(jìn)行侵染，之后再延伸到玉米莖、玉米絲和玉米穗[11]。本文通過使用苯胺藍(lán)染色法對(duì)侵染甘蔗葉片的輪枝鐮刀菌進(jìn)行染色，觀察到病菌的分生孢子首先在甘蔗葉片的氣孔及毛狀體等侵染入口處萌發(fā)并長(zhǎng)出芽管，芽管伸長(zhǎng)發(fā)育成菌絲，繼而出現(xiàn)放射狀的菌絲分枝，突破宿主細(xì)胞壁并進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。這一過程與前人觀察到輪枝鐮刀菌侵入玉米葉片的過程非常相似[11]。

毛狀體是存在于植物表皮上的附屬物，Nguyen等發(fā)現(xiàn)玉米葉片表面有3種類型的毛狀體，呈不規(guī)則排列[12]。甘蔗葉片表面存在2種類型的毛狀體，分別對(duì)應(yīng)玉米上的雙細(xì)胞毛狀體和刺毛，但沒有觀察到對(duì)應(yīng)的剛毛，相反在甘蔗葉片的邊緣有大剛毛（macro trichomes）[17]。本研究發(fā)現(xiàn)FvCNO-1能夠通過甘蔗葉片上的雙細(xì)胞毛狀體和刺毛進(jìn)行侵染，但未能確定是否能通過大剛毛進(jìn)行侵染（圖1 B）。

本研究在接種FvCNO-1分生孢子48 h內(nèi)只觀察到孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)及侵染，未觀察到菌絲產(chǎn)孢，晚于禾谷鐮刀菌分生孢子侵染玉米后48 h開始產(chǎn)生分生孢子[23]，其原因可能與獲取營(yíng)養(yǎng)及受甘蔗防御機(jī)制的影響有關(guān)。我們注意到不同甘蔗品種在田間條件下對(duì)梢腐病的抗性有很大差異，因此，比較梢腐病菌對(duì)抗病和感病品種的侵染過程，將有助于闡明甘蔗抗感梢腐病的機(jī)制，為抗病品種培育和病害防控提供指導(dǎo)。