酪丁酸梭菌清除飼料中玉米赤霉烯酮的能力

鄭文秀，趙倩如，江 凌，黃 和，朱麗英

(1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800； 2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800； 3.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；4.南京工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

隨著飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，谷物和動(dòng)物飼料受到真菌毒素的污染已成為目前全球亟待解決的嚴(yán)重問(wèn)題。在過(guò)去的10年中，工廠、研究機(jī)構(gòu)和監(jiān)督部門都將注意力集中于飼料安全上[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年有25%的糧食作物會(huì)受到真菌毒素的污染[2]，如黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)，玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等。

ZEN是一種非甾體雌激素真菌毒素，主要由幾種鐮刀菌產(chǎn)生，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌，其最初于1962年從發(fā)霉的玉米中分離出來(lái)[3]。ZEN污染主要發(fā)生在谷物中，例如玉米、小麥、大麥、黑麥和高粱等。而玉米作為能量飼料不僅被全世界養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用，而且是發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)不可或缺的支柱飼料。

目前，全球玉米的70%～80%都用于飼料，我國(guó)50%用作飼料，因此玉米有“飼料之王”的美稱[4]。由于不適宜的氣候條件和環(huán)境因素，玉米可能在生長(zhǎng)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和加工的各個(gè)環(huán)節(jié)受到ZEN的污染，導(dǎo)致ZEN在玉米及其副產(chǎn)品中富集，從而對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[5]。 動(dòng)物攝入ZEN污染的飼料后，健康遭受嚴(yán)重?fù)p害，造成生長(zhǎng)和繁殖表現(xiàn)缺陷。而ZEN的雌激素活性可以進(jìn)入食物鏈，人類食入受污染的有毒素殘留物的家禽產(chǎn)品，如肉類、肝臟或雞蛋，可能也會(huì)導(dǎo)致健康受損，誘發(fā)中樞性性早熟，生殖問(wèn)題以及導(dǎo)致一些乳腺癌發(fā)病率的增加[6]。為了保護(hù)人類和動(dòng)物的健康，歐盟對(duì)ZEN設(shè)定了嚴(yán)格的限制：未加工谷物在食品中的定量為100 μg/kg，未加工玉米在飼料中的定量為350 μg/kg。根據(jù)文獻(xiàn)[7]的報(bào)道，目前中國(guó)設(shè)定飼料中ZEN的最大殘留限量為500 μg/kg，谷物和谷物制品為60 μg/kg。

鑒于ZEN對(duì)動(dòng)物和人類的嚴(yán)重危害，如何利用有效的手段清除飼料中ZEN已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，物理法、化學(xué)法和生物法是人們現(xiàn)在研究常用的三大方法。其中，物理法包括添加營(yíng)養(yǎng)惰性吸附劑和擠壓蒸煮，常用的營(yíng)養(yǎng)惰性吸附劑為鋁硅酸鹽和含有黏土的鋁硅酸鹽，然而其商業(yè)用途由于成本高而受限制；擠壓蒸煮是現(xiàn)代食品加工新技術(shù)之一，盡管能提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性，但仍需證明ZEN的毒性或生物活性已降低或完全消除[8]。化學(xué)法包括使用高濃度的臭氧、H2O2進(jìn)行處理，可以部分破壞ZEN，但是缺少ZEN代謝物及其潛在毒性的信息[8]。生物法則是解決真菌毒素污染最具前景的方法，據(jù)報(bào)道多種細(xì)菌和真菌的生物降解能力已被表征[9]，因而通過(guò)微生物降解作用或吸附作用將毒素清除或降解為無(wú)毒產(chǎn)物已是目前研究的熱點(diǎn)。

酪丁酸梭菌是一種廣泛應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥和化工等行業(yè)的厭氧菌株。在飼料領(lǐng)域，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)酪丁酸梭菌可作為新型飼料添加劑，以提高牲畜的免疫力水平和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，減少抗生素的使用，其主要代謝產(chǎn)物丁酸可以作為動(dòng)物生長(zhǎng)代謝所需的營(yíng)養(yǎng)元素。與抗生素相比，在飼料中添加酪丁酸梭菌具有綠色無(wú)污染、無(wú)耐藥性和無(wú)有害殘留等特點(diǎn)，現(xiàn)正在逐漸被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料行業(yè)中[10]。

筆者對(duì)其清除液體中ZEN能力和影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，將酪丁酸梭菌進(jìn)行活菌培養(yǎng)、熱處理和酸處理，在不同菌濃條件下吸附ZEN，利用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)樣品中ZEN含量，以確定酪丁酸梭菌對(duì)ZEN的清除率和各個(gè)因素的影響。并且對(duì)酪丁酸梭菌馴化培養(yǎng)，比較其清除率，以期為今后研究酪丁酸梭菌在動(dòng)物飼料中的脫毒作用奠定一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)CCTCC W428，由食品與輕工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存[10]。

1.2 材料與試劑

酵母粉、蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司；甲醇，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；葡萄糖、NaCl、牛肉浸膏、十二水合磷酸氫二鈉、可溶性淀粉、無(wú)水乙醇、NaOH，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、無(wú)水乙酸鈉、KCl，廣東光華化學(xué)廠有限公司；HCl、分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；ZEN，以色列Fermentek公司；乙腈、色譜純，北京百靈威科技有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、刃天青，美國(guó)Sigma公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，NaCl 5 g/L，無(wú)水乙酸鈉3 g/L，酵母浸粉3 g/L，可溶性淀粉1 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，刃天青0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；pH 6.8。

磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L，pH 7.4)：十二水合磷酸氫二鈉 2.9 g、KH2PO40.2 g、NaCl 8 g和KCl 0.2 g溶解于去離子水中，定容至1 L。

ZEN儲(chǔ)備液：精密稱量10 mg，用色譜級(jí)乙腈溶解，并定容至10 mL，配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存待用。

1.3 儀器與設(shè)備

YXQ-1型厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；Ultrospec 3300 pro型分光光度計(jì)，美國(guó)Amersham Biosciences公司；WGL-230B型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；3K15型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；HH-4型恒溫水浴鍋，太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)儀器廠；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀，美國(guó)Dionex公司；DMC 2900型顯微鏡，德國(guó)徠卡儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種的活化和培養(yǎng)

取-80 ℃甘油管保存的菌種，37 ℃靜態(tài)厭氧培養(yǎng)24 h，得到一級(jí)種子。繼續(xù)轉(zhuǎn)代2次，以三級(jí)種子作為發(fā)酵母種，接入含100 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基的500 mL厭氧瓶中，接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))，37 ℃下靜態(tài)厭氧培養(yǎng)待用。

1.4.2 酪丁酸梭菌清除ZEN能力的測(cè)定

酪丁酸梭菌的處理方法，結(jié)合參考文獻(xiàn)[12]并稍有修改，酪丁酸梭菌37 ℃靜態(tài)培養(yǎng)12 h后取樣，采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定菌體質(zhì)量濃度[13]，調(diào)整菌體密度為1.0×1010個(gè)/mL于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，菌體用PBS緩沖液洗滌，倒掉上清液，將菌體重懸于1 mL 培養(yǎng)基中，內(nèi)含20 μL 1 mg/mL ZEN，分別于37 ℃ 孵育2、 4、 6、 8、10、12和24 h，反應(yīng)結(jié)束后，離心取上清液，用HPLC分析上清液中的ZEN含量。采用相同的處理方法，控制其他影響因素一定，探究反應(yīng)溫度(20 、30、37和42 ℃)，培養(yǎng)基pH(4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)，初始菌體密度(1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個(gè)/mL)對(duì)酪丁酸梭菌清除ZEN的影響。

酪丁酸梭菌的預(yù)處理方法，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14]并稍有修改，分為活菌組、熱處理組和酸處理組。酪丁酸梭菌37 ℃靜態(tài)培養(yǎng)12 h后取樣，控制菌體密度為1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個(gè)/mL分別于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，菌體用PBS緩沖液洗滌?；罹M(37 ℃、4 mL PBS緩沖液孵育1 h)，熱處理組(4 mL PBS緩沖液中煮沸1 h)，酸處理組(37 ℃、4 mL 2 mol/L HCl 中孵育1 h)處理后，酸處理的菌體用PBS洗滌2次。將獲得的菌體重懸1 mL 培養(yǎng)基中，內(nèi)含1 mg/mL ZEN 20 μL，混勻后于37 ℃孵育24 h，離心取上清液，用HPLC分析ZEN的含量。以不含菌體的培養(yǎng)基和ZEN溶液為空白對(duì)照。ZEN清除率(Y)計(jì)算式見式(1)：

(1)

式中：S為酪丁酸梭菌處理后上清液中毒素的峰面積，S0為空白對(duì)照毒素的峰面積。

1.4.3 酪丁酸梭菌菌株的馴化

為了達(dá)到更好的清除ZEN毒素的效果，對(duì)其進(jìn)行菌種的馴化。100 mL的厭氧瓶中加入50 mL培養(yǎng)基，然后在第一代菌株的培養(yǎng)基中加入1 mg/mL的ZEN 20 μL(ZEN添加量可忽略不計(jì))，37 ℃培養(yǎng)10 h接種到第二代，并在10 h時(shí)取樣，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用可見光分光光度計(jì)于600 nm讀取菌懸液的OD值，為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，單次實(shí)驗(yàn)做3組平行試驗(yàn)。

第二代菌株的培養(yǎng)基中加入40 μL的ZEN，隨后依次多加入20 μL的ZEN，直至傳代到第50代。選取馴化后的菌種，3 000 r/min離心10 min，除去上清液，PBS緩沖液洗滌獲得菌體。選取3個(gè)初始菌體密度：1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個(gè)/mL，分別進(jìn)行酸處理和熱處理，方法同上，用HPLC檢測(cè)分析馴化后酪丁酸梭菌清除ZEN的含量。

1.4.4 高效液相色譜的檢測(cè)條件

取一定量的ZEN標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈分別稀釋成濃度25、20、15、10和5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。參照參考文獻(xiàn)[15]中使用的檢測(cè)條件，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行改進(jìn)，使用C18色譜柱 (250 mm× 4.6 mm，5 μm)，測(cè)試條件為流動(dòng)相乙腈和水的體積比60∶ 40，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，選用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。樣品過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，裝入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，用HPLC進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZEN標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為了對(duì)酪丁酸梭菌的脫毒效果進(jìn)行定量考察，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度與峰面積關(guān)系制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2 375.91+41 547.56x，R2=0.999，見圖1。

由圖1可知：在5～25 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。

圖1 ZEN標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ZEN

2.2 酪丁酸梭菌對(duì)ZEN的清除效果

2.2.1 時(shí)間對(duì)清除效果的影響

以初始菌體密度為1.0×1010個(gè)/mL的酪丁酸梭菌重懸于1 mL培養(yǎng)基(pH 4.0)，添加最終ZEN質(zhì)量濃度為20 μg/mL，于37 ℃下孵育2、4、6、8、10、12和24 h，清除毒素ZEN結(jié)果見圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)酪丁酸梭菌清除ZEN的影響Fig.2 The impact of time on the removal of ZEN by Clostridium tyrobutyricum

由圖2可知：酪丁酸梭菌吸附清除ZEN是個(gè)持續(xù)的過(guò)程。在2 h時(shí)清除率為28.4%；在24 h后，達(dá)到最高值31.0%。隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)將會(huì)逐漸減慢，吸附發(fā)生后，細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)及其所帶電荷發(fā)生了改變，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)力較強(qiáng)時(shí)，ZEN無(wú)法吸附到細(xì)胞表面；而當(dāng)細(xì)胞表面改變，細(xì)胞生長(zhǎng)力降低，ZEN與細(xì)胞結(jié)合則相對(duì)容易，因此細(xì)胞吸附毒素的量總體呈逐漸上升趨勢(shì)[16]。但也有研究表明[17-18]：細(xì)胞吸附毒素是一個(gè)快速可逆的過(guò)程，當(dāng)吸附達(dá)到一定時(shí)間后，少量毒素也會(huì)釋放到溶液中，出現(xiàn)毒素清除率降低的情況，推測(cè)細(xì)胞與毒素之間結(jié)合的比較松散，而后毒素將被細(xì)胞重新結(jié)合。

2.2.2 溫度對(duì)清除效果的影響

溫度也是影響細(xì)胞結(jié)合ZEN的一個(gè)因素，因?yàn)榧?xì)胞有合適的生長(zhǎng)溫度，毒素也有存在的最適溫度。以初始菌體密度為1.0×1010個(gè)/mL的酪丁酸梭菌重懸于1 mL培養(yǎng)基(pH 4.0)，添加最終ZEN質(zhì)量濃度為20 μg/mL，分別于20 、30 、37和42 ℃下孵育24 h，清除毒素ZEN結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)酪丁酸梭菌清除ZEN的影響Fig.3 The impact of temperature on the removal of ZEN by Clostridium tyrobutyricum

由圖3可知：溫度為37 ℃時(shí)ZEN清除率最高，推測(cè)可能與此溫度下菌體生長(zhǎng)代謝活力最強(qiáng)有關(guān)[11]。

2.2.3 pH對(duì)清除效果的影響

以初始菌體密度為1.0×1010個(gè)/mL的酪丁酸梭菌重懸于1 mL 培養(yǎng)基(pH 分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)，添加最終ZEN質(zhì)量濃度為20 μg/mL，于37 ℃下孵育24 h，清除毒素ZEN結(jié)果見圖4。

由圖4可知：不同pH環(huán)境下，細(xì)胞吸附ZEN的效果也有差別，因?yàn)閆EN在不同pH溶液中的分子結(jié)構(gòu)有所不同。ZEN是一種內(nèi)酯型結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境的條件下可以將酯鍵打開。根據(jù)Miao等[16]的研究表明，ZEN有2種酚式羥基。當(dāng)pH小于7時(shí)，ZEN主要以內(nèi)酯型的形式存在，因其非極性疏水作用，ZEN更易被細(xì)胞壁的非極性成分吸附或者進(jìn)入內(nèi)部的非極性孔道；當(dāng)初始pH上升，在堿性環(huán)境的條件下可以將酯鍵打開，ZEN將形成陰離子，使其難與細(xì)胞表面的親水極性成分結(jié)合。因此，當(dāng)pH為4時(shí)，細(xì)胞對(duì)毒素的吸附效果較好。

圖4 pH對(duì)酪丁酸梭菌清除ZEN的影響Fig.4 The impact of pH on the removal of ZEN by Clostridium tyrobutyricum

2.2.4 不同預(yù)處理方法對(duì)清除效果的影響

為了考察酪丁酸梭菌清除ZEN的能力，選擇4種菌體密度1.0×108、1.0×109、1.0×1010和1.0×1011個(gè)/mL，分別通過(guò)使用不同處理方法對(duì)酪丁酸梭菌細(xì)胞進(jìn)行處理，其對(duì)玉米赤霉烯酮的清除效果見圖5。

由圖5可知：當(dāng)菌體密度為1.0×108個(gè)/mL時(shí)，酪丁酸梭菌對(duì)ZEN就展現(xiàn)了清除的能力，隨著菌體濃度的升高，ZEN清除率也逐漸增大，尤其是菌體密度為1.0×1011個(gè)/mL時(shí)，活菌組(31.9%)、熱處理組(44.2%)和酸處理組(50.2%)的清除效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)菌體密度為1.0×108個(gè)/mL，顯示出菌株處理ZEN最好的清除效果，但是與菌體密度為1.0×1010個(gè)/mL時(shí)的清除效果相當(dāng)，說(shuō)明菌體密度的增大，有利于ZEN含量的降低，但當(dāng)菌密度超過(guò)一定后，對(duì)清除毒素的效果就不顯著了，這與Zhao等[17]利用植物乳酸菌吸附ZEN的研究結(jié)果類似。

圖5 不同細(xì)胞密度對(duì)清除ZEN的影響Fig.5 The impact of cell density on the removal of ZEN under different treatments

除此以外，當(dāng)菌體密度一定時(shí)，通過(guò)對(duì)比活菌組，熱處理組和酸處理組清除毒素的效果，發(fā)現(xiàn)酪丁酸梭菌經(jīng)過(guò)熱和酸處理后，清除毒素的能力明顯增強(qiáng)，且經(jīng)過(guò)酸處理后的酪丁酸梭菌在菌體密度為1×1010個(gè)/mL時(shí)，清除率可達(dá)49.3%，而熱處理組為42%，活菌組為30.4%，分別增加了7.3%和18.9%。這樣的結(jié)果可能有幾種解釋：1)熱處理和酸處理可能改變了活有機(jī)體的原始結(jié)合位點(diǎn)，并且暴露了新的結(jié)合位點(diǎn)[14]，這樣細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ZEN的親和力就可能增加，從而表現(xiàn)出更好的清除效果；2)酪丁酸梭菌的細(xì)胞壁主要成分是多糖和肽聚糖，經(jīng)過(guò)熱處理可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，或者多糖與肽和蛋白質(zhì)之間形成了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物；3)經(jīng)過(guò)酸處理，多糖的糖苷鍵斷裂，單體被釋放，進(jìn)一步可轉(zhuǎn)化成醛。肽和蛋白質(zhì)間的酰胺鍵也被破壞，產(chǎn)生肽和氨基酸，且可能改變了肽聚糖的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁的厚度，從而孔徑增加[17-18]，有利于細(xì)胞對(duì)ZEN的吸附清除。由此推斷，酪丁酸梭菌清除毒素的機(jī)制是吸附作用；且通過(guò)熱處理和酸處理，酶失去活性，這也證明了酪丁酸梭菌清除毒素不是在酶的作用下轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。

2.3 酪丁酸梭菌菌株對(duì)高濃度ZEN的馴化研究

為了增強(qiáng)酪丁酸梭菌清除ZEN的能力，達(dá)到更好的清除效果，成為飼料添加劑中清除毒素的高效菌株，將其進(jìn)行適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，使其能夠在有毒素的環(huán)境中具備較高的耐受力和活動(dòng)能力。將ZEN添加進(jìn)酪丁酸梭菌的培養(yǎng)基中，以20 μL ZEN為起點(diǎn)，每代培養(yǎng)10 h后接種于下一代，每一代的培養(yǎng)基中均逐代增加20 μL ZEN，以此規(guī)則馴化50代，最后一代的ZEN添加量為1 000 μL，終濃度20 μg/mL。50代酪丁酸梭菌生長(zhǎng)第10 h連成的生長(zhǎng)曲線圖見圖6。

由圖6可知：從第1～第15代，酪丁酸梭菌生長(zhǎng)第10小時(shí)的OD均較低，說(shuō)明菌體生長(zhǎng)緩慢，從第16代開始，酪丁酸梭菌OD逐漸增加，生長(zhǎng)迅速，說(shuō)明酪丁酸梭菌對(duì)ZEN的耐受性已逐漸增強(qiáng)，生存能力也逐漸增加。經(jīng)過(guò)適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，猜想酪丁酸梭菌菌株的某種表型或者生理特性發(fā)生了改變，但目前具體機(jī)制不明，有待研究。且馴化后的酪丁酸梭菌不排除具有其他有害特性的可能，還有待進(jìn)一步探究馴化后酪丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物變化及毒性分析，繼而進(jìn)行安全性評(píng)估。

圖6 酪丁酸梭菌生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of Clostridium butyricum

為了進(jìn)一步測(cè)試馴化后的酪丁酸梭菌清除ZEN的能力，選擇1.0×109、1.0×1010和1×1011個(gè)/mL 3種菌體密度，同樣進(jìn)行熱處理和酸處理，清除效果見圖7。

圖7 馴化后不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞密度對(duì)清除ZEN的影響Fig.7 The impact of cell density on the removal of ZEN under different treatments after domestication

由圖7可知：馴化后的菌株清除ZEN的能力得到了顯著地提高，當(dāng)菌體密度達(dá)到1.0×1011個(gè)/mL時(shí)，經(jīng)過(guò)酸處理后的酪丁酸梭菌對(duì)毒素的吸附效果最好，可吸收Z(yǔ)EN達(dá)98.5%，并且酸處理組比未馴化酸處理組提高了48.3%，熱處理組比未馴化熱處理組提高了53.1%。總體來(lái)說(shuō)，酸處理后的清除效果優(yōu)于熱處理。由此證明，通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)馴化菌株的過(guò)程能夠獲得一株耐ZEN毒素性能較好的馴化菌株，同時(shí)，成功獲得具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的馴化菌株說(shuō)明了ZEN濃度逐漸增加的條件下能夠提高菌株的耐受性能，維持菌株的細(xì)胞活性并保證其穩(wěn)定生長(zhǎng)?？紤]到將來(lái)會(huì)將馴化的酪丁酸梭菌運(yùn)用于實(shí)際中，除了其安全性有待考察外，將其加入飼料中吸附毒素后，飼料還需要進(jìn)行沖刷、洗滌和烘干等步驟，以及時(shí)去除吸附毒素的酪丁酸梭菌菌體。

3 結(jié)論

酪丁酸梭菌作為新型的飼料添加劑，不僅能夠促進(jìn)家禽腸道內(nèi)其他有益菌的快速生長(zhǎng)，維持菌群平衡，在本文中得到驗(yàn)證還能夠吸附飼料中的ZEN，起到有效清除飼料中毒素的效果。筆者考察了孵育時(shí)間、溫度、pH及初始菌濃對(duì)酪丁酸梭菌吸附ZEN效果的影響，且通過(guò)使用不同的處理方法對(duì)酪丁酸梭菌細(xì)胞進(jìn)行處理，熱處理組和酸處理組吸附ZEN的效果明顯高于活菌組，并且菌體密度控制在1.0×1011個(gè)/mL時(shí)，經(jīng)過(guò)酸處理的酪丁酸梭菌清除ZEN的效果最佳。隨后酪丁酸梭菌經(jīng)過(guò)50代的連續(xù)培養(yǎng)馴化，其清除ZEN的能力明顯提高，在毒素環(huán)境中的生存能力也逐漸增強(qiáng)，同樣的，馴化后的酪丁酸梭菌經(jīng)酸處理后，初始菌體密度為1.0×1011個(gè)/mL，培養(yǎng)基pH為4.0，于37 ℃孵育24 h時(shí)，對(duì)ZEN的清除率可達(dá)到98.5%，實(shí)現(xiàn)了吸附的最佳效果。

由此，本研究為酪丁酸梭菌清除飼料中的ZEN毒素奠定了研究基礎(chǔ)，有望對(duì)飼料的改良提供理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。