高壓均質對肌原纖維蛋白乳化特性及結構的影響

刁小琴，關海寧，李楊，劉麗美

(綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化,152061)

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)是豬肌肉總蛋白的50%～55%[1]，它具有的持水性、乳化性及凝膠性等功能特性，影響著肉制品的彈性、黏合性以及質地，決定產(chǎn)品的最終品質。為了更好地發(fā)揮肌原纖維蛋白的功能特性，常采用物理改性、化學改性、酶改性等技術對其進行修飾。高壓均質是近些年發(fā)展起來的一種高新改性技術，它利用均質過程產(chǎn)生的空化、剪切、湍流等作用改變蛋白的結構和功能特性[2]。

關于高壓均質的研究報道已有很多[3-8]，但目前國內(nèi)外尚未有關于豬肉肌原纖維蛋白經(jīng)高壓均質處理后乳化特性改善的研究報道，同時在實際生產(chǎn)中，受機械設備的限制，部分均質機的均質壓力一般不超過40 MPa，本研究采用均質壓力(20 MPa和40 MPa)、均質次數(shù)(1次和2次)對肌原纖維蛋白進行改性，并研究其結構的變化，以期為高壓均質應用于肌原纖維蛋白的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的豬背最長肌，黑龍江北大荒肉業(yè)有限公司；大豆色拉油，安徽中糧油脂有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，北京華邁科生物技術有限責任公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)，上海源葉生物有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)，上海邁瑞爾化學技術有限公司；牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司。

酒石酸鉀鈉、無水CESO4、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCL等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SRH60-70高壓均質機，上海申鹿均質機有限公司；T18 basic型勻漿機，德國IKA公司；Mastersizer 3000型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文公司；Zetasizer Nano型馬爾文電位儀，英國馬爾文公司；TU-190雙光束紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；GL-21M型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；F96S熒光分光光度計，上海棱光技術有限公司；AVATAR360傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的高壓均質處理

參照GUO等[9]的方法從豬背最長肌中提取肌原纖維蛋白，具體操作如下：將除去脂肪和結締組織的肉樣絞碎，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含NaCl、MgCl2和EGTA，pH 7.0)低溫提取3次，沉淀用0.1 mol/L NaCl洗液洗滌2次后，加入NaCl洗液，勻漿60 s，4層紗布過濾，濾液分成5份，其中1份不經(jīng)均質處理作對照，剩余4份進行不同條件的高壓均質處理(20 MPa 均質1次和2次；40 MPa均質處理1次和2次，后續(xù)用20-1、20-2、40-1、40-2表示)，隨后用0.1 mol/L HCl調節(jié)pH值至6.0，3 500 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，取沉淀，真空冷凍干燥備用。以牛血清蛋白為標準品，采用雙縮脲法測定蛋白含量[10]。

1.3.2 溶解性測定

將不同均質處理的MP配成10 g/L的溶液，4 000 r/min離心40 min后，用雙縮脲法測定上清液的吸光值，溶解度用上清液的蛋白含量與樣品中的總蛋白含量的百分比來表示。

1.3.3 粒徑測定

將不同均質處理的MP配成1 g/L的溶液，室溫(25 ℃)環(huán)境下，以蒸餾水作為分散介質，采用激光粒度分析儀測定粒徑大小和分布，測定結果以體積等效平均粒徑(D4,3)表示。

1.3.4 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照RAMIREZ-SUAREZ等[11]的方法，將8 mL 10 mg/mL的MP溶液與2 mL大豆色拉油混勻后用高速分散均質機10 000 r/min勻漿1 min，立即從底部0.5 cm處取50 μL乳化液與5 mL SDS溶液(濃度為1 mg/g)混勻，在500 nm波長下測其吸光值。同時，測定室溫放置10 min后的樣品。乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)按式(1)和(2)計算：

(1)

(2)

式中：ρ，乳化前的蛋白質量濃度，g/mL；φ，乳化液中油的體積比；n，稀釋倍數(shù)；A0，初始乳化液在500 nm波長下的吸光度；A10，10 min后乳化液500 nm處的吸光度。

1.3.5 乳化液電位測定

將 50 μL不同均質處理的MP乳化液與5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0，10 mmol/L)混勻后注入彎曲毛細管樣品池中，使用馬爾文激光粒度儀在常溫下測定乳化液電位。

1.3.6 總巰基和活性巰基的測定

參照BEVERIDGE等[12]的方法測定。將15 mg樣品用5.0 mL緩沖液(0.086 mol/L Tris, 0.09 mol/L甘氨酸, 4 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶解，用于總巰基含量測定的緩沖液中包含8 mol/L的尿素，用于活性巰基含量測定的緩沖液中不包含尿素。然后加入50 μL 的Ellman試劑，漩渦混勻后避光反應1 h，10 000 r/min 離心15 min(4 ℃)。測上清液的蛋白含量及在412 nm處的吸光值?？値€基和活性巰基含量使用2-硝基-5-硫代苯甲酸(NTB)的摩爾消光系數(shù)13 600 mol/(L·cm) 計算，單位為μmoL/g。

1.3.7 表面疏水性的測定

根據(jù)KATO等[13]的方法，以ANS為熒光探針，利用熒光分光光度計測定不同均質處理后的蛋白質的表面疏水性。蛋白質量濃度被稀釋在5～500 μg/mL，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設置為365 nm和484 nm。以蛋白質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，所得曲線的斜率即為表面疏水性指數(shù)。

1.3.8 紅外光譜分析

真空冷凍干燥后的樣品粉末與溴化鉀混合研磨并壓片，恒溫箱里平衡5 min，紅外光譜儀掃描，范圍4 000～600 cm-1，分辨率4 cm-1，每個樣品圖譜掃描重復3次，采集紅外光譜圖。利用OMNIC 8.0對圖譜進行處理后，使用Peak fit 4.2軟件對1 600～1 700 cm-1酰胺I段的圖譜進行分析，經(jīng)過圖譜過濾、平滑和基線校正處理后，用Gaussian函數(shù)對圖譜進行去卷積、二階求導，估計出各個疊加的子峰個數(shù)和峰位，通過二階導數(shù)多次擬合直至殘差最小，確認各子峰位歸屬，α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲含量的相對含量根據(jù)各子峰的積分面積計算[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復3次，結果表示為平均數(shù)±SD。差異顯著性分析采用Statistix 8.1軟件進行，作圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結果與分析

2.1 高壓均質對肌原纖維蛋白功能特性的影響

2.1.1 高壓均質對肌原纖維蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質水化作用的重要體現(xiàn)，蛋白質的水化作用加強，其溶解度升高，蛋白質的高溶解性對肉制品加工至關重要。不同均質壓力與次數(shù)對肌原纖維蛋白溶解性的影響見圖1。

經(jīng)均質壓力為20 MPa和40 MPa，均質次數(shù)為1次和2次的處理組，其溶解度均顯著優(yōu)于未經(jīng)高壓均質處理的對照組(P< 0.05)，其中經(jīng)40 MPa均質1次的處理組其溶解度表現(xiàn)為最高。溶解度提高的原因可能是肌原纖維蛋白受到強烈剪切和振蕩等作用，其緊密結構逐漸展開，蛋白質內(nèi)部的極性基團裸露出來，表面電荷增多，結合于新暴露的極性基團的水也增多，蛋白質的水化作用加強，其溶解度上升[15]。當均質次數(shù)增加時，溶解度反而降低，可能是由于多次均質使蛋白分子過度展開，疏水作用增強，形成了難溶的聚集體，因而溶解度下降，故選擇1次均質最為適宜[16]。FLOUR等[17]采用高于150 MPa的均質壓力處理大豆球蛋白，結果發(fā)現(xiàn)其溶解性喪失，分析原因也可能是蛋白發(fā)生聚集所導致。

圖1 高壓均質對肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig.1 Effect of high pressure homogenization treatment on solubility of MP注：圖中不同小寫字母表示差異顯著，下同。

2.1.2 高壓均質對肌原纖維蛋白粒徑的影響

粒徑分布能夠反映蛋白的聚集程度。由圖2可以看出，與未經(jīng)高壓均質處理的對照相比，均質處理的蛋白，其粒徑均朝著粒徑變小的方向移動，且均質壓力越高，移動越明顯，40 MPa均質處理1次的變化效果最顯著。圖3體積平均粒徑D4，3也表明，隨著均質壓力的增加，D4，3顯著降低，40 MPa均質處理1次的D4，3最小，說明高壓均質能夠使蛋白分子發(fā)生解聚，使其粒徑變小。DUMAY等[18]也報道高壓均質產(chǎn)生的機械力破壞了蛋白結構，使其粒徑減小。

圖2 高壓均質對肌原纖維蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of high pressure homogenization treatment on particle size distribution of MP

圖3 高壓均質對肌原纖維蛋白粒徑的影響Fig.3 Effect of high pressure homogenization treatment on particle size of MP

2.1.3 高壓均質對肌原纖維蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化能力指乳狀液在相轉變前每克蛋白質所能乳化油的體積。肉的乳化能力主要表現(xiàn)在肉中蛋白質固定脂肪的能力，乳化能力高意味著能夠固定更多的脂肪，也意味著加工制成穩(wěn)定的乳化肉產(chǎn)品時能夠減少跑油的現(xiàn)象。高壓均質對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖4 高壓均質對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of high pressure homogenization treatment on emulsifying activity and emulsion stability of MP

由圖4可以看出，經(jīng)均質壓力20 MPa和40 MPa，均質次數(shù)為1次和2次的處理組，其乳化活性均優(yōu)于未經(jīng)高壓均質處理的對照組，其中經(jīng)40 MPa均質1次的處理組其乳化活性表現(xiàn)最高，乳化值達到47.45 m2/g，這與溶解性的結果相一致。可能是由于蛋白質溶解性提高，會使更多的蛋白溶于水，進而加快了蛋白的遷移，使更多的蛋白吸附到油水界面，從而乳化活性提高。然而相同的均質壓力下，均質2次的乳化活性均低于均質1次，這可能是多次均質使得疏水作用增強，進而形成不溶的聚集物，降低了蛋白遷移到油水界面的機率，乳化活性降低。乳化穩(wěn)定性隨著均質壓力的變化趨勢與乳化活性變化趨勢相似。

2.1.4 高壓均質對肌原纖維蛋白乳化液電位的影響

乳化液滴表面的帶電性質能夠反映液滴間的相互作用，進而說明乳化液的乳化能力。乳化液滴表面電荷的多少可通過電位來反映。電位的正負通常是由乳液所處的pH值決定，乳液的pH高于蛋白等電點，乳液就帶負電荷，低于蛋白等電點，乳液就帶正電荷[19]。

圖5 高壓均質對肌原纖維蛋白電位的影響Fig.5 Effect of high pressure homogenization treatment on zeta potential of MP

圖5中未經(jīng)高壓均質處理的MP的電位為(-13.1±0.954)mV，隨著均質壓力的增加，電位絕對值顯著升高，說明表面帶的負電荷逐漸增強，液滴間的靜電斥力增強，進而阻礙了液滴間的聚集，使乳液的穩(wěn)定性增強，這與乳液穩(wěn)定性結果相一致。

2.2 高壓均質對肌原纖維蛋白結構的影響

2.2.1 高壓均質對肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響

總巰基指位于蛋白質分子表面的活性巰基和包埋于蛋白質分子內(nèi)部的巰基，即蛋白質分子的所有巰基，活性巰基指暴露于蛋白質分子表面的巰基[20]。巰基含量的變化反映蛋白的結構改變，進而影響蛋白質的功能性質[21]。隨著均質壓力的增加，肌原纖維蛋白總巰基呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，而活性巰基呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這可能是因為高壓均質使蛋白分子結構變得松散，埋藏于分子內(nèi)部的巰基基團逐漸暴露于表面，并隨著壓力的增加暴露逐漸增加，然而當均質壓力為40 MPa，均質2次時，活性巰基含量開始減少，究其原因，可能是多次均質使蛋白分子結構因聚集而變得緊密，進而使活性巰基含量減少。

圖6 高壓均質對肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響Fig.6 Effect of high pressure homogenization treatment on total sulfhydryl content and exposed sulfhydryl content of MP

另外，處理過程是在空氣中進行的，暴露于表面的巰基易氧化生成二硫鍵，從而使總巰基含量下降。

2.2.2 高壓均質對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性反映蛋白質表面疏水性氨基酸的相對含量，對維持蛋白質構象的穩(wěn)定具有重要的作用，在一定程度上能夠表征蛋白質結構的改變。由圖7可以看出，隨著均質壓力及次數(shù)的增加，表面疏水性呈上升趨勢，可能是高壓處理破壞了蛋白質的高級結構，使其解折疊，進而蛋白內(nèi)部的疏水性氨基酸如色氨酸和苯丙氨酸等殘基暴露于蛋白表面，增加了蛋白的表面疏水性。KO等[22]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理羅非魚肌動球蛋白后其表面疏水性增加，張自業(yè)[23]采用超高壓處理雞肉肌原纖維蛋白，也得出表面疏水性增加的結論。另外，張晶等報道80 MPa的壓力處理大米蛋白，其表面疏水性增加，乳化活性得到改善。也有研究報道，表面疏水性增加，能夠降低界面張力，增加蛋白質與油脂之間的相互作用，利于乳化層形成，進而使其乳化性提高[24]，本研究也得到類似的結論。

圖7 高壓均質對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.7 Effect of high pressure homogenization treatment on surface hydrophobicity of MP

2.2.3 高壓均質處理后肌原纖維蛋白的紅外光譜分析

圖8 高壓均質處理后的肌原纖維蛋白紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectroscopy of MP after high pressure homogenization treatment

由圖9也可以看出，隨著均質壓力的增加，α-螺旋和β-折疊含量減少，β-轉角和無規(guī)卷曲含量增加，表明高壓均質使α-螺旋和β-折疊向β-轉角和無規(guī)卷曲轉化，蛋白分子由有序向無序結構轉變。

圖9 高壓均質處理后的肌原纖維蛋白二級結構含量的變化Fig.9 The secondary structure contents changes of MP after high pressure homogenization treatment

這可能是隨著均質壓力的增大，肌原纖維蛋白分子間的氫鍵作用減小，分子間的相互作用減弱，蛋白質分子展開，結構變得松散，蛋白內(nèi)部的非極性基團暴露，蛋白質二級結構發(fā)生了變化，表現(xiàn)為α-螺旋、β-折疊含量的降低以及表面疏水性的增加。王辰等[28]采用紅外光譜分析大豆分離蛋白結構的變化，結果發(fā)現(xiàn)蛋白的表面疏水性與α-螺旋呈負相關與無規(guī)則卷曲呈正相關。WANG等[29]也研究表明大豆分離蛋白的表面疏水性與β-折疊含量的變化呈負相關。

3 結論

采用均質壓力(20 MPa和40 MPa)、均質次數(shù)(1次和2次)對肌原纖維蛋白進行改性，結果發(fā)現(xiàn)高壓均質能夠改善MP的理化性和乳化性，均質壓力為40 MPa，均質次數(shù)為1次的處理組表現(xiàn)出較低的粒徑和較高的溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性以及電位絕對值。通過對總巰基和活性巰基的分析得出其含量隨著均質壓力的變化而變化，表面疏水性隨著均質壓力的增加，也表現(xiàn)出上升趨勢，紅外光譜表明均質處理能夠改變肌原纖維蛋白的二級結構，α-螺旋和β-折疊含量減少，β-轉角和無規(guī)卷曲含量增加。然而關于均質處理過程中結構的變化機理有待進一步研究。