中藥提取物對諾如病毒滅活的研究＊

王書菁，施曉峰，廖寧波，吳康軍，周文婕，盧宇劍，程東慶＊＊

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 杭州 310053；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心 杭州 310051）

諾如病毒（Norovirus,NoV）屬于杯狀病毒科（Caliciviruses）的諾瓦克病毒屬，諾如病毒感染性極強(qiáng)，是引起人類急性胃腸炎的最常見病原微生物之一[1]。中國自1995年報(bào)告首例諾如病毒感染病例后，國內(nèi)許多地區(qū)多次暴發(fā)諾如病毒感染性急性胃腸炎案例[2]。2016 年10 月17 號，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)接到43 名學(xué)生反應(yīng)消化系統(tǒng)不適，出現(xiàn)嘔吐、發(fā)熱、腹瀉的癥狀，事后確診39 名為諾如病毒感染＊＊＊中新網(wǎng).http：//news.jxntv.cn/2016/1017/8177862.shtml。2014 年1 月下旬，浙江嘉興市海寧、海鹽兩地部分學(xué)校出現(xiàn)聚集性學(xué)生惡心嘔吐腹瀉等癥狀，經(jīng)當(dāng)?shù)丶部刂行臋z測確定為諾如病毒感染＊＊＊＊人民網(wǎng).http：//politics.people.com.cn/n/2014/0220/c70731-24414205.html。目前諾如病毒尚未有疫苗面世，也沒有特異的抗病毒藥物[3]。諾如病毒已成為一個日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

資料顯示，G Ⅱ型諾如病毒（Genogroups ⅡNorovirus，GⅡ.NoV）是中國的流行優(yōu)勢株，一般通過糞-口傳播。糞-口傳播包括了食源性、水源性以及人-人直接接觸傳播[4]。食物中的諾如病毒滅活一般采用熱高壓即可滅活[5]，國內(nèi)外針對諾如病毒的滅活研究主要是水體中的諾如病毒。在傳統(tǒng)水處理工藝中，國內(nèi)外均采用總大腸菌群或大腸菌群作為評價水處理效果的指示微生物，水處理中病毒的安全問題未得到應(yīng)有的重視[6]，而且水體很難做到完全清除病毒，因此開發(fā)和完善諾如病毒的檢測及滅活技術(shù)，對諾如病毒的預(yù)防控制將起到重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究中藥提取物對諾如病毒的滅活效果，為減少諾如病毒污染、保障公共衛(wèi)生健康提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

諾如病毒陽性樣品：由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供，樣品保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

中藥材：魚腥草（Houttuynia cordata）購自興寧市長城醫(yī)藥有限公司泰安藥行，天然蜂膠原膠（Propolis）購于江蘇泰安市農(nóng)家養(yǎng)蜂園。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SKY-200B型恒溫培養(yǎng)搖床；MLS-3020CH型高壓蒸汽滅菌鍋；ABI 7500 熒光定量PCR 儀；1300 系列A2型生物安全柜；金屬?。蛔贤鈿⒕鷥x；W2010B 型數(shù)控恒溫水浴鍋；TC-15 恒溫電熱套；R-20J 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-D-III 型循環(huán)水真空泵；SHP 250 型生化培養(yǎng)箱；DHG 9420A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；DR/2400 型便攜式分光光度計(jì)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Qiagen RNeasy Mini Kit（74104，Qiagen）、QIAamp Viral RNA Mini Kit（52904，Qiagen）、One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit（RR064A，Takara）、人諾如病毒抗原ELISA檢測試劑盒（18584，上海江萊生物技術(shù)有限公司）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 中藥提取物的制備[7-10]

中藥材清洗干燥后打成粗粉用于提取。

水提法：稱取50 g的藥物粉末，加蒸餾水1 L，95℃提取4 h，過濾除渣，取濾液。濾渣中再加蒸餾水1 L，按上法再次抽提2 h后過濾除渣，取濾過液，合并兩次濾過液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥。

醇提法：稱取50 g 的藥物粉末，采用95%乙醇提取，按照1∶10的料液比，95℃提取4 h，過濾除渣，取濾液。濾渣中再加95%乙醇1 L，按上法再次抽提2 h 后過濾除渣，取濾過液，合并兩次濾過液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥。

1.4.2 RT-qPCR檢測病毒含量

采用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取樣品中的核酸為模板，用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit 試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。引物和探針均由上海生工有限公司合成，引物[11,12]序列（表1）、反應(yīng)體系（表2），42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min 后95℃預(yù)變性2 min，變性5 s、55℃退火35 s 共40個循環(huán)。

表1 RT-qPCR引物和探針序列

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系

1.4.3 中藥提取物對諾如病毒滅活的量效、時效關(guān)系研究

量效關(guān)系研究：中藥提取物（濃度1、10、25、50 mg·mL-1）室溫下與100 μL 的病毒懸液孵育30 min，設(shè)立溶劑對照組（只加100 μL的DMSO和100 μL的病毒懸液）；空白對照組（加入100 μL 的無菌水和100 μL的病毒懸液），應(yīng)用RT-qPCR 進(jìn)行檢測，檢出Ct 值越大，滅活效果越明顯。

時效關(guān)系研究：中藥提取物（濃度50 mg·mL-1）室溫下與100 μL 的病毒懸液孵育一定時間（0、15、30、60、120 min），設(shè)立溶劑對照組（只加100 μL 的DMSO和100 μL的病毒懸液）；空白對照組（加入100 μL的無菌水和100 μL 的病毒懸液），應(yīng)用RT-qPCR 進(jìn)行檢測，檢出Ct值越大，滅活效果越明顯。

1.4.4 滅活機(jī)理一——對諾如病毒蛋白外殼的破壞作用研究

中藥提取物（濃度1、10、25、50 mg·mL-1）室溫下與100 μL的病毒懸液孵育30 min，設(shè)立溶劑對照組（只加100 μL的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和100 μL的病毒懸液）；空白對照組（加入100 μL的無菌水和100 μL 的病毒懸液），用ELISA 試劑盒檢測結(jié)構(gòu)未被破壞的完整病毒蛋白，檢測OD值越低說明對病毒的破壞作用越好。以紫外輻射法9 000 μ W·cm-2作用30 min、二氧化氯以10 mg·mL-1的濃度作用30 min、5%雙氧水作用30 min作為對照。

1.4.5 滅活機(jī)理二——對諾如病毒核酸的破壞作用

病毒滅活處理方法同上，提取病毒核酸，逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增GII.NoV 特異性片段,瓊脂糖凝膠電泳檢測各處理組核酸序列的完整性，擴(kuò)增引物（表3）、擴(kuò)增反應(yīng)體系（表4），42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min后，95℃預(yù)變性5 s、變性35 s、55℃退火共40個循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物公司測序，比較各組序列的完整性，考察對核酸的破壞作用。

表3 GII.NoV 特異性片段擴(kuò)增所用引物

表4 GII.NoV 特異性片段擴(kuò)增體系

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 中藥提取物對病毒滅活的量效關(guān)系

中藥提取物與GII.NoV 作用30 min，在0-50（mg·mL-1）劑量范圍內(nèi)，與對照組相比，蜂膠醇提物和魚腥草水提物均對諾如病毒有一定滅活作用，且隨著濃度提高，效果越明顯。

2.2 中藥提取物滅活病毒的時效關(guān)系

以50 mg·mL-1的劑量與GII.NoV 作用0、15、30、60、120 min，隨著滅活時間的增加，病毒量不斷降低；30 min到1 h之間滅活達(dá)到最大效果，作用1-2 h之間，滅活效果增加不再明顯。

2.3 中藥提取物/紫外/二氧化氯/雙氧水方法滅活效果的比較

比較50 mg·mL-1蜂膠醇提物滅活30 min、50 mg·mL-1魚腥草水提物滅活30 min，輻射劑量9 000 μ W·cm-2紫外作用30 min，10 mg·mL-1二氧化氯作用30 min、5%雙氧水作用30 min（圖1），五種方法對水中GII.NoV 均有顯著滅活效果，10 mg·mL-1二氧化氯作用30 min 后可以滅活85.13%的GII.NoV，9000 μ W·cm-2的紫外作用30 min后滅活率達(dá)到96.7%、5%雙氧水作用30 min后滅活率達(dá)到81.09%；而蜂膠醇提物和魚腥草水提物作用30 min后可以滅活97.03%和97.88%的病毒，略高于其他滅活方法。

表5 中藥提取物對GII.NoV的滅活作用（±s，n=5）

表5 中藥提取物對GII.NoV的滅活作用（±s，n=5）

表6 中藥提取物作用時間對GII.NoV的滅活影響（±s，n=5）

表6 中藥提取物作用時間對GII.NoV的滅活影響（±s，n=5）

注：與對照組比較，P＜0.05

圖1 五種滅活方法對GII.NoV的滅活效果

2.4 五種滅活方法對諾如病毒蛋白外殼的破壞作用

蜂膠醇提物、魚腥草水提物、紫外線、二氧化氯和雙氧水處理諾如病毒后通過ELISA檢測結(jié)構(gòu)未被破壞的完整病毒蛋白，其OD 值結(jié)果（表7）。與對照組相比，魚腥草水提物、紫外線、二氧化氯和雙氧水處理OD值均明顯下降，說明病毒外殼蛋白表面抗原受到了破壞，其中尤以二氧化氯和紫外效果最為明顯；但是蜂膠醇提物對諾如病毒顆粒的破壞作用不明顯。

表7 五種滅活方法處理后病毒液ELISA和RT-qPCR雙重檢測結(jié)果

圖2 幾種滅活方法處理前后的諾如病毒RT-PCR瓊脂凝膠電泳分析圖

表8 五種方法滅活處理后3對引物的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 ORF1的蛋白編碼位點(diǎn)

表9 消毒處理后諾如病毒ORF1核酸突變情況

2.5 5種滅活方法對諾如病毒核酸的破壞作用

5種方法滅活處理后，提取病毒核酸，擴(kuò)增特異性片段，擴(kuò)增結(jié)果（圖2，表8），魚腥草組和雙氧水組3個片段均未能擴(kuò)增成功，蜂膠組、紫外組僅片段2擴(kuò)增成功，二氧化氯組則成功擴(kuò)出了第1、2片段。

RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物公司測序，利用DNAstar分析測序片段，為更好地觀察突變的程度，分別定義了保守點(diǎn)、突變點(diǎn)和高突變點(diǎn)，保守點(diǎn)堿基沒有發(fā)生變化，含有3 個堿基以內(nèi)突變的為突變點(diǎn)，3 個以上堿基發(fā)生突變的為高突變點(diǎn)，分別計(jì)算突變率從而可以清楚地發(fā)現(xiàn)序列的變異情況。

圖2 和表8 可見ORF2 和ORF3（片段3）均未能擴(kuò)增出，只有部分ORF1（片段1和片段2）能完整擴(kuò)增出，因此筆者著重對ORF1 上的6 個蛋白區(qū)域進(jìn)行詳細(xì)分析。ORF1 結(jié)構(gòu)如圖3 所示，5’-N 端開始依次分別是p48、NTPase、p22、VPg、Pro及RdRp。

將有0-5 個堿基突變的定義為“+”，有5-10 個堿基突變的定義為“++”，將有10個以上堿基突變的定義為“+++”。5 種滅活方法處理后，ORF1 上各位點(diǎn)的突變情況（表9）。

3 討論

我國貝類產(chǎn)量已連續(xù)10多年名列世界第一，是我國水產(chǎn)品的重要組成部分。然而由于我國的水產(chǎn)品污染嚴(yán)重，檢測技術(shù)滯后，相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)不能和國際接軌等種種因素，水產(chǎn)品出口屢次遭遇國際技術(shù)性貿(mào)易壁壘的限制，其中一項(xiàng)就是諾如病毒不得檢出。2004年5月，新加坡農(nóng)業(yè)食品獸醫(yī)局(Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore，AVA)從我國三批出口凍牡蠣檢出諾如病毒，貨物被退回。在此之前的2002 年，美國農(nóng)業(yè)部用RT-PCR方法從進(jìn)口中國文蛤中檢測出諾如病毒，導(dǎo)致中國出口到美國的文蛤受阻，使我國的貝類養(yǎng)殖業(yè)蒙受重大損失。

對貝類食源性病毒的滅活研究起步比較晚，研究的文章并不多，缺乏系統(tǒng)性。而諾如病毒對各種外界理化因素都有較強(qiáng)的抵抗力，在室溫條件下于pH 為2.7 的環(huán)境中暴露3 h 仍具有感染性[13]；酒精處理諾如病毒后，病毒無法被滅活[14]；在含3.75-6.25 mg·L-1氯的普通飲用水中，諾如病毒仍表現(xiàn)出一定的耐受性[15]；在10 mg·L-1高濃度氯離子（處理污水采用的氯離子）存在時才能被滅活[16]。諾如病毒對高溫、冰凍、高壓等也有一定的抵抗力：60℃作用30 min后，病毒不能完全滅活[17]；將含有諾如病毒的食品基質(zhì)冰凍6個月后，其活性幾乎不受影響。

筆者選取蜂膠醇提物和魚腥草水提物對GII.NoV的滅活規(guī)律進(jìn)行研究。在以0-50 mg·mL-1的中藥提取物作用30 min時，隨著濃度的增加，對諾如病毒的滅活效果越好。室溫下，蜂膠醇提物和魚腥草水提物以50 mg·mL-1為作用濃度，GII.NoV的減少率在30 min-1 h時達(dá)到最高，分別為1.16-1.77 log10和1.67-2.29 log10，表明中藥提取物對諾如病毒的滅活效率存在一定的時效性。蜂膠醇提物和魚腥草水提物作用30 min后可以滅活97.03 %和97.88 %的病毒，略高于其他滅活方法。在貝類收獲后，預(yù)先用含有上述提取物的溶液進(jìn)行浸泡或者銷售運(yùn)輸過程中的儲藏水里加入上述提取物，將有助于殺滅諾如病毒，有效地保障我國水產(chǎn)品衛(wèi)生安全，全面促進(jìn)我國水產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展。