尤瑞克林對急性腦缺血再灌注大鼠血管新生因子表達的影響

孫洲 曹非 駱芳 向栩瑩 晏桂林 陸觀鳳 楊燕澤 鐘玉馨

(1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430022；2湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院;3武漢市普愛醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

過去對于缺血性腦卒中的治療大多集中在神經(jīng)保護方面，而忽視了缺血血管結(jié)構(gòu)及功能重建可能帶來的益處〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn)，梗塞交界區(qū)新生的血管周圍逐漸出現(xiàn)神經(jīng)干細胞的生長，二者在神經(jīng)損傷后修復中出現(xiàn)同步現(xiàn)象，極可能是新生的血管為神經(jīng)元提供血供和營養(yǎng)支持的結(jié)果〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)尤瑞克林(HUK)促進血管新生可能通過上調(diào)抑制血管抑素表達〔4〕、升高堿性成纖維細胞生長因子〔5〕等機制。本實驗從血管新生因子的角度進一步探討HUK的腦保護機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 SD雄性大鼠采購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物供應中心，均在SPF級大鼠飼養(yǎng)室由專員飼養(yǎng)。大鼠缺血再灌注(I/R)造模成功后隨機分為假手術(shù)(Sham)組(假手術(shù)+生理鹽水)，模型(I/R+生理鹽水)組、HUK低劑量(LDP)組(3.5×10-3PNAU/kg)、HUK中等劑量(MDP)組(8.75×10-3PNAU/kg)、HUK高劑量(HDP)組(17.5×10-3PNAU/kg)，均為尾靜脈注射。每組選用5只成功雄性大鼠。

1.2I/R大腦中動脈梗塞模型制備 大鼠右側(cè)局灶性大腦中動脈I/R模型采用改良后Zea Longa線栓方法〔6〕，于缺血2 h檢測模型成功后拔出線栓，形成I/R。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，充分游離頸外動脈、頸內(nèi)動脈。本實驗中動物處理方法符合動物倫理學標準。

1.3實驗藥物及制劑 實驗用藥為注射用HUK干粉針劑(凱力康)，購于廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格為0.15 PNAU/支。各組實驗藥物劑量設(shè)定均按實驗動物HUK安全劑量換算，參照既往研究大鼠折算后用藥劑量〔7〕。

1.4Western印跡測定磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-110α、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管生成素(Ang)-1蛋白表達 制備腦組織提取物，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉后，孵育一抗和二抗，最后顯色曝光。蛋白印跡條帶用Image J圖像軟件分析，測定各指標條帶及內(nèi)參條帶的相對灰度值后分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)使用GraphPad軟件進行繪圖。

1.5統(tǒng)計學方法 運用SPSS16.0軟件行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組PI3K-110α和eNOS表達比較 I/R 7 d，模型組與Sham組PI3K-1102、eNOS差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；LDP組明顯高于模型組(P<0.05)，HDP組明顯高于MDP組(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 HUK上調(diào)I/R后7 d各組血管新生相關(guān)因子或受體表達比較

與模型組比較：1)P<0.05；與MDP組比較：2)P<0.05

圖1 HUK上調(diào)I/R后7 d PI3K-110α和eNOS表達

2.2各組Ang-1和Ang受體(Tie)-2表達比較 I/R 7 d,與模型組比較，Sham組Ang-1和Tie-2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，LDP組能明顯上調(diào)Ang-1蛋白表達(P<0.05)，MDP組與LDP組相比，Tie-2蛋白表達明顯增高(P<0.05)。HDP組較MDP組能明顯上調(diào)Ang-1蛋白水平及Tie-2表達水平(P<0.05)。見表1和圖2。

圖2 HUK上調(diào)I/R 7 d后Ang-1和Tie-2受體表達

2.3各組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和VEGF受體(VEGFR)-2表達比較 I/R 7 d,模型組較Sham組VEGF表達水平顯著升高(P<0.05)，VEGFR-2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HDP組較 MDP組能明顯上調(diào)VEGF表達(P<0.05)。MDP組較 LDP組VEGFR-2表達顯著增高(P<0.01)；HDP組較MDP組顯著上調(diào)VEGFR-2表達(P<0.01)。見表1和圖3。

圖3 HUK上調(diào)I/R 7 d后VEGF和VEGFR-2表達

3 討 論

急性腦缺血后需及早開放病灶周圍循環(huán)及促進血管新生，從而達到減少腦組織缺血、保護神經(jīng)功能和改善臨床預后的目的。促血管新生、改善循環(huán)涉及較多通路及機制，其中內(nèi)皮祖細胞(EPCs)、成熟內(nèi)皮細胞(ECs)激活、分化、增殖、遷移是血管出芽新生的重要過程已成為共識，本實驗中各劑量HUK促進PI3K、eNOS上調(diào)，可能通過兩條重要信號通路：PI3K/蛋白激酶B(Akt)/eNOS通路〔6〕和緩激肽受體B2(B2R)/PI3K/eNOS信號通路〔7〕促進血管擴張增加缺血區(qū)血流灌注，并促進EPCs和ECs遷移增加血管新生而起到神經(jīng)保護作用。本研究提示，HUK在出芽新生血管穩(wěn)定成熟期間也發(fā)揮了重要作用，且該作用大小呈HUK劑量效應關(guān)系。VEGF是血管新生最主要的因子之一，本研究HUK中、大劑量，尤其是大劑量可能通過PI3K-Akt-GSK-3β-VEGF-VEGFR-2途徑上調(diào)VEGF及VEGFR-2促進再灌注后新生血管形成〔8,9〕。

綜上，HUK可能通過多途徑改善腦梗死灶循環(huán)，除促血管新生外，還可通過上調(diào)eNOS釋放NO以擴張缺血區(qū)微血管，上調(diào)Tie-2等表達穩(wěn)定新生血管從而發(fā)揮神經(jīng)功能保護作用，且HUK的這些作用在一定程度上呈現(xiàn)出劑量-效應相關(guān)性。