異丙腎上腺素對心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及caspase-9的影響

韓芬 楊曉

(1鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部)，河南 鄭州 451460；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科)

目前，急性冠脈綜合征患病率大大增加，已被看作是冠心病主要的致死原因之一〔1〕。冠狀動脈血管旁路移植術(shù)、冠狀動脈介入治療、溶解血栓等均是挽救缺血心肌的主要再灌注方式〔2〕。然而盡管上述方法治療效果尚佳，但心肌再灌注損傷仍是限制各治療方法深入推行的阻礙，可見如何避免或減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷對改善患者預(yù)后尤為關(guān)鍵〔3〕。既往研究證實，β腎上腺素能受體(β-AR)參與了心電生理、心臟血液供應(yīng)等生命活動，并在這些進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用〔4，5〕。β1-腎上腺素受體(AR)、β2-AR均參與了心臟功能活動，在正常的生理情況下，β1-AR主要介導(dǎo)交感神經(jīng)激動，而β2-AR則參與了心力衰竭等病理條件下的心功能調(diào)節(jié)〔6〕。本研究旨在觀察異丙腎上腺素(ISO)對心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)與心肌凋亡的影響，以期為急性冠脈綜合征再灌注預(yù)處理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 成年雄性SD大鼠40只，平均體重(227.47±19.25)g，均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2實驗儀器 DH-140動物呼吸機：泰盟科技有限公司；RM-6280型多導(dǎo)生理記錄分析系統(tǒng)：成都市儀器公司；光學(xué)顯微鏡：日本奧林普斯公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海圣科公司；石蠟包埋機：武漢天之瑞公司；分光光度計：上海譜元公司；酶標(biāo)儀：芬蘭雷勃公司；電泳儀：BIO-RAD；數(shù)字病理掃描系統(tǒng)：美國Aperio公司；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.1.3實驗試劑 ISO：美國Sigma公司；ICI118551：美國Sigma公司；20%烏拉坦：武漢博士德公司；蘇木素-伊紅：碧云天研究所；β-actin抗體、磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)單克隆抗體：美國abcam公司；原位末端標(biāo)記試劑：美國Roche公司；羊抗兔二抗：Bioswamp公司；caspase-9免疫組化試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：碧云天研究所；丙二醛(MDA)試劑盒：上海酶聯(lián)生物公司；磷酸緩沖液(PBS)：聯(lián)科生物公司。

1.2方法

1.2.1大鼠模型建立 將選中的40只大鼠稱重，向其腹腔內(nèi)注射5 mg/kg 20%烏拉坦麻醉。麻醉后取仰臥位使用膠布將其固定于工作臺上，密切監(jiān)測動物心電圖機與呼吸機是否在正常狀態(tài)下，選擇實驗需要的相關(guān)器材，開始模型建立。方法如下：使用針型電極放置于大鼠四肢皮下，密切觀察監(jiān)護儀并分析其心電圖，心電圖通常選擇Ⅱ?qū)?lián)。對手術(shù)視野使用碘伏棉簽消毒，頸正中切開氣管行氣管插管，與呼吸機連接，大鼠麻醉呼吸比1∶2，根據(jù)每公斤體重提供7 ml的比值設(shè)定潮氣總量，設(shè)置呼吸頻率為80次/min。沿著大鼠胸骨左緣3～4肋間依次將皮膚、皮下脂肪、肌層分離，待心臟顯露后使用棉簽將心包輕輕分離并將左心耳部分掀起，小心結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)，使用套管將血管夾閉，30 min后將套管松開完成120 min灌流，I/R模型建立成功后，結(jié)扎血管。血管成功結(jié)扎標(biāo)準(zhǔn)：LAD供血區(qū)心肌呈灰暗狀，心電圖ST-T段抬高，放松后ST-T段回落≥50%。

1.2.2實驗?zāi)Ｐ头纸M 根據(jù)隨機數(shù)表法分為假手術(shù)(Sham)組、I/R組、ISO組及β2-AR拮抗劑(ICI)組，每組10只。

1.2.3大鼠模型處理方法 Sham組大鼠在LAD處僅穿線但不結(jié)扎，麻醉時間為150 min；I/R組大鼠先將LAD結(jié)扎30 min，然后放松灌注缺血心肌120 min；ISO組：先使用ISO 10 mg/kg腹腔內(nèi)注射，60 min后制備心肌I/R損傷模型；ICI組：使用ICI118551腹腔注射，劑量為0.5 mg/kg，注射30 min后使用ISO腹腔內(nèi)注射，劑量為10 mg/kg，注射60 min后再制備大鼠I/R模型。為了便于平衡對照，需要為Sham組、I/R組SD大鼠適量生理鹽水腹腔內(nèi)注射。

1.3觀察指標(biāo) (1)心肌組織病理形態(tài)：取大鼠心肌梗死部分組織，石蠟包埋切片后染色，利用光學(xué)顯微鏡400倍觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)；(2)P-Akt蛋白表達(dá)：使用剪刀截取心肌缺血區(qū)域組織并制備心肌碎片，裂解后離心，取上清液封存待檢。經(jīng)蛋白定量、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯色等方法步驟，利用化學(xué)發(fā)光法檢測。(3)心肌凋亡檢測：采用TUNEL法，將缺血心肌組織置于10%甲醛中充分固定24 h，脫水石蠟包埋，經(jīng)400倍光學(xué)顯微鏡觀察，若觀察到棕色細(xì)胞核則確認(rèn)為凋亡細(xì)胞，若細(xì)胞核為藍(lán)色則屬于非凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)=細(xì)胞凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。(4)caspase-9蛋白表達(dá)：將大鼠灌注心肌經(jīng)10%甲醛浸泡固定48 h后脫水、組織包埋、切片制作，置于載玻片上待檢。于載玻片上加入單克隆抗體，過夜，沖洗2次，向內(nèi)加入山羊血清稀釋，室溫下反應(yīng)2 h，將多余液體甩去，PBS沖洗玻片，吸水紙將周圍殘余液體吸除，根據(jù)需要向內(nèi)加入鏈霉卵白素，標(biāo)記在室溫下孵化，清洗后制備二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，室溫下顯色；再次經(jīng)蘇木素浸泡20 s，自來水沖洗。干燥后鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)caspase-9凋亡細(xì)胞，經(jīng)數(shù)字病理掃描系統(tǒng)分析灰度值，灰度值與caspase-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。(5)血清氧化應(yīng)激反應(yīng)：再灌注120 min后經(jīng)腹主動脈抽取動脈血0.5 ml，離心后取上清液，使用氧化酶法檢測SOD表達(dá)，使用巴比妥酸法檢測MDA表達(dá)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，計量資料用t檢驗，4組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1心肌組織病理形態(tài) Sham組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰、整齊排列，胞質(zhì)無水腫，間質(zhì)正常；I/R組心肌纖維發(fā)生變性、中斷，可見細(xì)胞間質(zhì)水腫；ISO組可見心肌纖維變性、排列紊亂，但程度較I/R組相對輕微，間質(zhì)情況好；ICI組心肌纖維較ISO組變性嚴(yán)重且錯亂排列，有大量核溶解與破裂，間質(zhì)明顯加寬，有大量炎性細(xì)胞侵入。見圖1。

圖1 各組心肌形態(tài)學(xué)病理改變(×400)

2.2心肌組織P-Akt表達(dá) I/R組心肌P-Akt蛋白表達(dá)(0.57±0.11)較Sham組(0.25±0.03)明顯升高，ISO組心肌P-Akt蛋白表達(dá)(1.20±0.18)較I/R組明顯升高，ICI組心肌P-Akt表達(dá)(0.36±0.09)較ISO組明顯降低(均P<0.05)。

2.3心肌細(xì)胞凋亡比較 與Sham組〔(23.01±4.25)%〕比較，I/R組心肌細(xì)胞凋亡比例〔(40.12±6.45)%〕顯著升高；與I/R組比較，ISO組凋亡比例〔(28.41±8.11)%〕明顯降低；ICI組凋亡比例〔(41.57±8.24)%〕較ISO組明顯升高；組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)比較 I/R組血清SOD水平較Sham組明顯降低，MDA表達(dá)較Sham組明顯升高；ISO組血清SOD表達(dá)較I/R組水平升高，MDA表達(dá)明顯降低；ICI組血清SOD表達(dá)較ISO組明顯降低，MDA表達(dá)明顯升高；組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

2.5caspase-9表達(dá) 與Sham組比較，I/R組心肌纖維內(nèi)caspase-9呈高表達(dá)；與I/R組比較，ISO組心肌纖維內(nèi)caspase-9呈低表達(dá)；與ISO組比較，ICI組心肌纖維內(nèi)caspase-9呈高表達(dá)；組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 4組SOD、MDA、caspase-9表達(dá)水平比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與I/R組比較：2)P<0.05；與ISO組比較：3)P<0.05

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，使用ISO 10 mg/kg經(jīng)腹腔注射預(yù)處理的方式能很好地對抗大鼠心肌I/R損傷〔7〕。Tong等〔8〕在2005年的大鼠離體試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ISO 10 mmol/L缺血預(yù)處理后具有一定心臟保護之效，對縮小心肌梗死面積有一定價值。但Tang等〔9〕在2011年的研究中發(fā)現(xiàn)，將2.5 mg/kg ISO持續(xù)皮下注射7 d 后，藥物能通過上調(diào)Cx43蛋白表達(dá)、氧化應(yīng)激等機制增加心肌肥厚風(fēng)險，加重心肌I/R損傷程度。

本研究中ISO組大鼠心肌組織形態(tài)規(guī)整性更好，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)表達(dá)更理想，且心肌細(xì)胞凋亡比例更低，提示激活β2-AR能夠幫助I/R心肌獲益。既往與心肌I/R損傷及β-AR有關(guān)的實驗研究指出，激活β-AR會損傷心肌，但也可能保護心肌〔10～12〕。β1-AR將對蛋白激酶A產(chǎn)生激活之效，抑制細(xì)胞色素-C氧化酶活性，加重再灌注梗死程度；而β2-AR則主要通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)途徑對抗心肌I/R損傷〔13，14〕，這些論述均與本研究結(jié)果近乎一致。

本次研究結(jié)果提示ISO可能通過激活心肌I/R損傷大鼠PI3K-Akt通路對心肌凋亡產(chǎn)生抑制，進(jìn)而對心肌I/R損傷產(chǎn)生保護作用，該機制與最新研究中提出的大鼠心肌I/R經(jīng)藥物預(yù)處理后起到的心肌保護作用類似〔15〕。在心肌I/R損傷挽救酶信號系統(tǒng)中，PI3K-Akt通路是最關(guān)鍵的信號通路之一，故調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程是該信號通路最顯著且關(guān)鍵的作用之一〔16〕。caspase家族是PI3K-Akt信號通路下游細(xì)胞凋亡家族，被看作是凋亡信號傳導(dǎo)主要途徑，屬于天冬氨酸特異性水解酶，富含半胱氨酸〔17，18〕。caspase-9是該家族中主要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子，能夠在其他相關(guān)細(xì)胞調(diào)解下，對核內(nèi)核酸酶直接激活，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA裂解，觸發(fā)甚至增加細(xì)胞凋亡〔19〕。近年來，氧化應(yīng)激損傷逐漸被認(rèn)為是心肌I/R損傷發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，SOD是抑制氧自由基損傷的重要屏障，能夠?qū)€原氧自由基產(chǎn)生催化之效，合成H2O2，在受到過氧化氫酶的刺激后能夠在機體內(nèi)還原為氧合水，對人體無害；MDA是膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其表達(dá)能夠直觀反映心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激程度。本研究結(jié)果顯示，ISO組大鼠氧化應(yīng)激水平顯著降低，提示ISO能夠顯著減輕心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，以對抗大鼠心肌I/R損傷。

綜上所述，ISO對心肌I/R損傷可產(chǎn)生保護之效，其機制可能與β2-AR興奮、PI3K-Akt途徑激活有關(guān)，能夠有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，起到抗氧化應(yīng)激之效；但因ISO在使用期間可能導(dǎo)致心肌損傷，誘發(fā)心律失常，故對于ISO應(yīng)用的安全性機制還待深入研究，其用于心肌I/R損傷的治療仍需要在未來進(jìn)行大量研究加以證實。