小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaNAC67參與調(diào)控穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)

張宏娟 李玉瑩 苗麗麗 王景一 李超男 楊德龍 毛新國(guó),* 景蕊蓮

小麥轉(zhuǎn)錄因子基因參與調(diào)控穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)

張宏娟1,2李玉瑩2,3苗麗麗2王景一2李超男2楊德龍1,*毛新國(guó)1,2,*景蕊蓮2

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/ 農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081;3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州 450002

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。前期研究表明,參與對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答, 過(guò)量表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥的抗逆性。為進(jìn)一步揭示其在調(diào)控小麥主要農(nóng)藝性狀發(fā)育方面的作用, 本研究以36份普通小麥組成的高多態(tài)性群體為材料, 測(cè)序分析了-、-、-序列多態(tài)性, 發(fā)現(xiàn)-啟動(dòng)子區(qū)–1516 nt有1個(gè)A/G轉(zhuǎn)換SNP, 在–873~ –748 nt處有1個(gè)126 bp的InDel;-啟動(dòng)子區(qū)–2014和–1916 nt處各有1個(gè)C/T轉(zhuǎn)換SNP;-啟動(dòng)子區(qū)–1795 nt有1個(gè)T/G顛換SNP, 編碼區(qū)357 nt處有1個(gè)C/T轉(zhuǎn)換SNP。根據(jù)多態(tài)性分別開發(fā)了功能分子標(biāo)記, 掃描由282份普通小麥構(gòu)成的自然群體, 并將基因型和表型性狀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,-、-的標(biāo)記與表型性狀無(wú)顯著關(guān)聯(lián), 而-的2個(gè)標(biāo)記SNP-D-1和SNP-D-2分別與小麥穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)顯著相關(guān)。單倍型分析發(fā)現(xiàn), 自然群體中存在3種主要單倍型, 其中-6D-3是增加穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)的最優(yōu)單倍型, 在我國(guó)小麥育種歷史中受到了正向選擇。轉(zhuǎn)基因水稻表型分析發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)能顯著增加水稻主穗穗長(zhǎng)、穗分枝和穗粒數(shù), 驗(yàn)證了小麥關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。因此,-可用于改良農(nóng)作物穗部性狀, 其分子標(biāo)記可用于小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種。

小麥; 轉(zhuǎn)錄因子; 單核苷酸多態(tài)性; 功能標(biāo)記; 單倍型; 關(guān)聯(lián)分析

小麥?zhǔn)鞘澜缱钪饕Z食作物之一。隨著氣候變化, 各種極端天氣事件頻發(fā), 嚴(yán)重影響了小麥生產(chǎn)。為確保糧食安全, 迫切需要培育抗逆、穩(wěn)產(chǎn)、廣適小麥新品種, 而挖掘利用小麥自身優(yōu)異遺傳資源是解決這一問(wèn)題的最經(jīng)濟(jì)有效途徑。NAC (NAM、ATAF和CUC)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 它不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用, 而且還參與對(duì)高鹽、低溫、低氧和干旱等多種非生物脅迫的響應(yīng)[1-3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員N端包含一個(gè)高度保守、特征性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 即NAC結(jié)構(gòu)域, 而C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域高度多樣化[4-6]。NAC家族成員廣泛存在于多種植物中[7], 其最早在矮牽牛中被發(fā)現(xiàn)[8], 隨后相繼在擬南芥、水稻、玉米、小麥、棉花、大豆等作物中被報(bào)道。

NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)根系發(fā)育, 如參與調(diào)控器官發(fā)生, 促進(jìn)根尖出現(xiàn)[9];參與調(diào)控根系構(gòu)型, 其過(guò)表達(dá)能改良水稻根系結(jié)構(gòu), 提高籽粒產(chǎn)量[10];過(guò)表達(dá)能增加轉(zhuǎn)基因水稻的穗數(shù)和灌漿速率[11];在根系中的過(guò)表達(dá)能夠增加水稻的小穗數(shù)[12]; 過(guò)表達(dá)能顯著增加擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)量[13];過(guò)表達(dá)不僅可增加小麥根系長(zhǎng)度和生物量, 還能提高抗旱性和水分虧缺條件下籽粒產(chǎn)量[14];過(guò)表達(dá)能促進(jìn)小麥根系伸長(zhǎng), 增加轉(zhuǎn)基因小麥的生物量[15]。NAC還參與調(diào)控葉片衰老, 如、、等過(guò)表達(dá)促進(jìn)擬南芥葉片早衰[16-18];過(guò)表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻抽穗提前, 葉片衰老加速[19]; 大麥中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致發(fā)育延遲, 并伴隨早衰[20]。

NAC參與對(duì)多種生物脅迫的應(yīng)答。如受馬鈴薯病原菌感染和損傷誘導(dǎo)表達(dá)[21]; 小麥?zhǔn)軛l銹病菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)[22];負(fù)調(diào)控小麥條銹病抗性[23];表達(dá)受稻瘟病誘導(dǎo), 其過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)植物防御反應(yīng)[24];正調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病和細(xì)菌性枯萎病的抗性, 其過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性[25]。

NAC在植物非生物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。如水稻、、、和等受低溫、干旱和高鹽度等多種非生物脅迫誘導(dǎo)[6,10,26-28], 過(guò)表達(dá)促進(jìn)鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡[26]。玉米過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥的耐旱性和耐鹽性, 提高存活率[29];受干旱、高鹽度和冷脅迫以及脫落酸(ABA)誘導(dǎo)[30]。小麥、和均受多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 過(guò)量表達(dá)能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)多種逆境的抗性[1,31-32]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),參與對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答, 其過(guò)量表達(dá)能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)多種逆境的抗性[33], 但有關(guān)是否參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育, 尤其是否參與調(diào)控重要農(nóng)藝性狀, 未見報(bào)道。

本研究通過(guò)測(cè)序發(fā)掘-、-、-等多態(tài)性位點(diǎn), 開發(fā)功能分子標(biāo)記, 掃描自然群體, 通過(guò)關(guān)聯(lián)分析揭示多態(tài)性位點(diǎn)與農(nóng)藝性狀的關(guān)系, 發(fā)掘優(yōu)異單倍型, 為小麥分子育種提供分子標(biāo)記和優(yōu)異基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)條件

試驗(yàn)材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供?；蚨鄳B(tài)性分析群體由36份多態(tài)性較高的普通小麥組成, 該群體是用209對(duì)SSR引物對(duì)262份材料進(jìn)行多態(tài)性分析后篩選出來(lái)的; 農(nóng)藝性狀分析群體(PA)包含了282份來(lái)自我國(guó)黃淮和北方冬麥區(qū)的普通小麥; 單倍型地理分布分析材料包括157份農(nóng)家品種組成的群體(PL)和348份現(xiàn)代育成品種組成的群體(PM)。挑取飽滿的種子放于培養(yǎng)皿中, 在人工氣候室內(nèi)水培至一葉一心, 取葉片提取DNA。

PA于2010—2013、2015—2017年種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義和昌平試驗(yàn)基地, 其中2010—2012、2015年僅在順義基地種植, 2013年只種在昌平基地種植, 田間水分管理分為雨養(yǎng)/干旱脅迫、灌溉2種條件, 共有30個(gè)環(huán)境(年份×地點(diǎn)×水分×熱脅迫)的表型數(shù)據(jù)。雨養(yǎng)/干旱脅迫是指在小麥的整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)不給予任何人工灌溉, 完全由雨水滋養(yǎng)生長(zhǎng); 灌溉是指在越冬前、孕穗期、開花期和灌漿期根據(jù)土壤墑情適時(shí)灌溉(750 m3hm–2); 熱脅迫是指在抽穗期通過(guò)覆蓋塑料膜創(chuàng)造高溫脅迫環(huán)境。7個(gè)小麥生長(zhǎng)季(2010、2011、2012、2013、2015、2016和2017年)的降雨量依次為131、180、158、163、173、143和116 mm。每份材料均勻點(diǎn)播在行長(zhǎng)2 m、間距0.3 m的4行小區(qū), 每行點(diǎn)播40粒種子。收獲時(shí)從每個(gè)小區(qū)中隨機(jī)取5株, 考察穗長(zhǎng)、每穗小穗數(shù)、穗粒數(shù)、株高、穗下節(jié)長(zhǎng)和千粒重等農(nóng)藝性狀。

1.2 TaNAC67序列單核苷酸多態(tài)性分析

根據(jù)克隆的-、-、-基因組序列, 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因組特異引物NAC67-6AsF/R、NAC67-6BsF/R和NAC67-6DsF/R (表1), 分別擴(kuò)增A、B、D基因組全長(zhǎng)序列。以多態(tài)性分析群體基因組DNA為模板, 用高保真DNA聚合酶TransStart FastPfu進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系包括5 × TransStart FastPfubuffer 6 μL, 2.5 mmol L–1dNTPs 2.4 μL, TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.6 μL, 正、反向引物(10 μmol L–1)各1.5 μL, 50 ng μL–1模板DNA 2 μL, 用ddH2O補(bǔ)至30 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min; 95℃ 1 min, 55~60℃ 45 s, 72℃ 3 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃, 10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物, 目的片段經(jīng)回收純化后, 連接pEASY-Blunt zero載體, 挑單克隆, 提取質(zhì)粒測(cè)序。

表1 試驗(yàn)中使用的引物

根據(jù)-、-、-序列信息, 設(shè)計(jì)基因組特異測(cè)序引物(表1), 用DNA Analyzer 3730測(cè)序。用DNASTAR Lasergene 7.1軟件包中的Seqman軟件進(jìn)行序列拼接、組裝, 用MegAlign軟件進(jìn)行序列多態(tài)性分析。

1.3 分子標(biāo)記開發(fā)

在-啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNP和1個(gè)126 bp的InDel, 即A-1516 (A/G)和A-126。在A-1516多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)含有內(nèi)切酶I酶切位點(diǎn)(TGC▼GCA)的CAPS特異引物A-1516-F/R, 在A-126 bp (–873~ –748 nt) InDel附近設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物A-126-F/R, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。

在-啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到2個(gè)SNP, B-2014 (C/T)和B-1916(C/T), 分別設(shè)計(jì)了dCAPS分子標(biāo)記。在B-2014 (C/T)前引入2個(gè)錯(cuò)配堿基TG, 形成能被I切開的酶切位點(diǎn)(CTGCA▼G); 在B-1916 (C/T)前引入一個(gè)錯(cuò)配堿基T, 使序列中含有I酶切位點(diǎn)(G▼CTAGC)。位點(diǎn)特異引物分別為B-1916-F/R和B-2014-F/R (表1)。

在-啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)各檢測(cè)到1個(gè)SNP, D-1795 (T/G)和D357 (C/T)。在D-1795位點(diǎn)設(shè)計(jì)CAPS特異引物D-1795-F/R (表1), 使序列中含有內(nèi)切酶Ⅲ酶切位點(diǎn)(GG▼CC)。在D357差異堿基前5 nt處引入錯(cuò)配堿基G, 使序列中含有I的酶切位點(diǎn)(G▼TCGAC), 特異引物為D357-F/R (表1)。

以小麥基因組DNA為模板, 利用基因組特異引物NAC67AsF/R、NAC67BsF/R和NAC67DsF/R分別擴(kuò)增得到第1輪PCR產(chǎn)物。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍, 取2 μL作模板進(jìn)行二次擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2× Utaq mix 10 μL, 正、反向引物(10 μmol L–1)各1 μL, 用ddH2O補(bǔ)至20 μL。-的2個(gè)SNP位點(diǎn)二輪PCR程序均為95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 65℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。的2個(gè)SNP位點(diǎn)二輪PCR程序均為95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 61℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min; D-1795多態(tài)性位點(diǎn)二輪PCR程序與B基因組SNP位點(diǎn)二輪PCR程序相同。D357多態(tài)性位點(diǎn)的第二輪PCR程序?yàn)?5℃ 5 min; 95℃ 1 min, 64℃ 30 s, 72℃ 30 s, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。取4 μL二輪PCR產(chǎn)物用對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化, 用5%瓊脂糖凝膠電泳分離,根據(jù)酶切后片段大小統(tǒng)計(jì)分析不同材料基因型。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

利用開發(fā)的分子標(biāo)記, 對(duì)農(nóng)藝性狀分析群體PA進(jìn)行基因型掃描, 發(fā)現(xiàn)存在4種單倍型。運(yùn)用TASSEL (version 5.2.51)軟件的一般線性模型GLM (general liner model), 把群體結(jié)構(gòu)(Q)作為協(xié)變量, 將-、-、-的基因型和表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。用SPSS (version 19.0)軟件進(jìn)行方差分析, 檢測(cè)不同基因型/單倍型性狀差異的顯著性。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻農(nóng)藝性狀測(cè)定

為進(jìn)一步解析在作物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能, 將全長(zhǎng)ORF克隆到雙元表達(dá)載體pCAMBIA1390上, 用電擊法轉(zhuǎn)導(dǎo)農(nóng)桿菌EHA105, 及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻(Kitaake)。用PCR方法檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因水稻, 并通過(guò)測(cè)序確定陽(yáng)性植株。收獲T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子, 在萌發(fā)期通過(guò)潮霉素抗性篩選轉(zhuǎn)基因后代, 得到T1代轉(zhuǎn)基因植株。在萌發(fā)期對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行潮霉素篩選, 根據(jù)根系生長(zhǎng)情況, 判斷T2代植株的分離比例, 篩選后代分離比符合3﹕1的株系進(jìn)行加代, 再經(jīng)潮霉素抗性篩選后得到T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。

將大小一致的水稻種子置培養(yǎng)皿中, 在光照培養(yǎng)箱中水培3~4 d, 挑選發(fā)芽一致的種子種在裝有草碳土的育苗盤中, 待長(zhǎng)至4~5葉時(shí), 將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽到大小相同、裝有相同體積腐殖土的塑料盒中(70 cm × 38 cm × 40 cm), 每盒18株, 轉(zhuǎn)基因株系后期水肥管理和野生型對(duì)照完全一致。在成熟期測(cè)定株高, 主穗長(zhǎng)、穗分枝和穗粒數(shù)。用自動(dòng)考種儀(萬(wàn)深SC-G)測(cè)量千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬, 用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaNAC67序列多態(tài)性

在六倍體普通小麥中克隆了的3種基因組序列, 基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)沒(méi)有內(nèi)含子, 序列比對(duì)表明它們分別來(lái)自小麥6A、6B和6D染色體,因此命名為-、-、-。-序列全長(zhǎng)3484 bp, 包括啟動(dòng)子區(qū)2453 bp和編碼區(qū)1031 bp;-序列全長(zhǎng)3431 bp, 其中啟動(dòng)子區(qū)2560 bp, 編碼區(qū)871 bp;-序列全長(zhǎng)3843 bp, 其中啟動(dòng)子長(zhǎng)2763 bp, 編碼區(qū)1080 bp。通過(guò)對(duì)36份高多態(tài)性普通小麥測(cè)序, 在-啟動(dòng)子區(qū)–1516 nt處有1個(gè)G/A轉(zhuǎn)換SNP, 在–873~ –748 nt處有一個(gè)126 bp的InDel (圖1-A)。在-啟動(dòng)子–2014和–1916 nt處存在2個(gè)C/T轉(zhuǎn)換SNP (圖2-A)。在-啟動(dòng)子–1795 nt和編碼區(qū)357 nt處各檢測(cè)到1個(gè)SNP, 分別是T/G顛換和C/T轉(zhuǎn)換(圖3-A)。

圖1 TaNAC67-6A序列多態(tài)性(A)及等位特異標(biāo)記SNP-A-1 (B)和CAPS標(biāo)記SNP-A-2 (C)

圖C: 當(dāng)–1516 nt基因型為A時(shí)不能被酶切, 當(dāng)基因型為G時(shí)能夠被酶切。M: 100 bp DNA ladder。

Fig. C: if the nucleotide at –1516 nt is A, the PCR product cannot be digested; if it is G, the PCR products can be digested. M: 100 bp DNA ladder.

2.2 TaNAC67-6A、TaNAC67-6B、TaNAC67-6D分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)-啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), 開發(fā)了1個(gè)等位特異標(biāo)記和1個(gè)CAPS標(biāo)記, SNP-A-1和SNP-A-2。根據(jù)–1516 nt處G-A轉(zhuǎn)換的差異, 設(shè)計(jì)含有內(nèi)切酶I酶切位點(diǎn)(TGC▼GCA)的特異擴(kuò)增引物。若–1516 nt處是A, 則PCR產(chǎn)物上沒(méi)有酶切位點(diǎn), 因此經(jīng)I消化處理后瓊脂糖凝膠電泳只有303 bp的單一條帶; 若–1516 nt為G, 則PCR產(chǎn)物經(jīng)I消化后產(chǎn)生273 bp和30 bp兩條帶(圖1-C)。在A-126 nt (–873~ –748 nt)附近設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物A-126-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 若有插入則PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后是490 bp單一條帶, 用+表示; 若沒(méi)有126 nt的片段插入, PCR產(chǎn)物只有一條364 bp的條帶,用“–”表示(圖1-B)。在PA群體中, –1516 nt處基因型A占33.33%, 基因型G占66.67%; 在InDel位點(diǎn), 有插入片段的基因型占5.71%, 沒(méi)有插入片段的占94.29%。

在啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn), –2014 nt (C/T)和–1916 nt (C/T), 分別開發(fā)了dCAPS分子標(biāo)記SNP-B-1和SNP-B-2。通過(guò)引入錯(cuò)配堿基, 分別設(shè)計(jì)含有內(nèi)切酶I (CTGCA▼G)和I (G▼CTAGC)的特異擴(kuò)增引物B-2014-F/R和B-1916- F/R (表1)。若–2014 nt處基因型為C, PCR產(chǎn)物能被酶切, 產(chǎn)生294和25 bp兩條帶; 若–2014 nt處基因型為T, PCR產(chǎn)物不含I酶切位點(diǎn), 因此電泳后只能看到319 bp單一條帶(圖2-B)。若–1916 nt基因型是C, PCR產(chǎn)物含有I酶切位點(diǎn), 能夠被酶切, 產(chǎn)生209 bp和23 bp兩條帶; 若在–1916 nt處是T, PCR產(chǎn)物不含酶切位點(diǎn), 電泳僅檢測(cè)到232 bp單一條帶(圖2-C)。PA群體在–2014 nt處基因型C占81.69%, 基因型T占18.31%; 在–1916 nt處, 基因型C占96.43%, 基因型T占3.57%。

根據(jù)-啟動(dòng)子和編碼區(qū)的2個(gè)SNP位點(diǎn)分別開發(fā)CAPS標(biāo)記SNP-D-1和dCAPS標(biāo)記SNP- D-2。SNP-D-1所在位點(diǎn)是G-T顛換差異, 直接設(shè)計(jì)含有內(nèi)切酶III (GG▼CC)的特異引物D-1795-F/R (表1)。若–1795 nt處是堿基T, 則PCR產(chǎn)物不含III酶切位點(diǎn)(GG▼CC), 不能被酶切, 電泳結(jié)果為308 bp單一條帶; 若是堿基G, PCR產(chǎn)物含有酶切位點(diǎn), 經(jīng)III消化處理后, 電泳結(jié)果為276 bp和32 bp兩條帶(圖3-B)。SNP-D-2所在位點(diǎn)是C-T轉(zhuǎn)換差異, 引入錯(cuò)配堿基, 設(shè)計(jì)有內(nèi)切酶I (G▼TCGAC)酶切位點(diǎn)的特異引物D357-F/R (表1)。若357 nt處堿基是T, PCR結(jié)果不含I (G▼TCGAC)酶切位點(diǎn), 不能被酶切, 電泳顯示為216 bp單一條帶; 若357 nt處差異堿基是C, 能夠被I酶切, 電泳結(jié)果顯示為200 bp和16 bp兩條帶(圖3-C)。PA群體在–1795 nt處, 基因型G占75.54%, 基因型T占24.46%; 在357 nt處, 基因型T占14.18%; 基因型C占85.82%。

圖2 TaNAC67-6B基因序列多態(tài)性(A)以及dCAPS標(biāo)記SNP-B-1 (B)和SNP-B-2 (C)

圖B: 當(dāng)–2014 nt基因型為C時(shí)能被酶切, 當(dāng)基因型為T時(shí)不能被酶切; 圖C: 當(dāng)–1916 nt基因型為T時(shí)不能被酶切, 當(dāng)基因型為C時(shí)能被酶切。M: 100 bp DNA ladder。

Fig. B: if the genotype at –2014 nt is C the PCR products can be digested; if it is T the PCR products cannot be digested. Fig. C: if the genotype at–1916 nt is T, the PCR products cannot be digested, if it is C the PCR products can be digested. M: 100 bp DNA ladder.

圖3 TaNAC67-6D序列多態(tài)性(A)以及CAPS標(biāo)記SNP-D-1 (B)和dCAPS標(biāo)記SNP-D-2 (C)

圖B: 當(dāng)–1795 nt基因型是G時(shí)能被酶切, 當(dāng)基因型為T時(shí)不能被酶切; 圖C: 當(dāng)357 nt基因型是T時(shí)不能被酶切, 當(dāng)基因型是C時(shí)能被酶切。M: 100 bp DNA ladder。

Fig. B: if the genotype at –1795 nt is G, the PCR products can be digested; if it is T the PCR products cannot be digested. Fig. C: if the genotype at 357 nt is T the PCR products cannot be digested, if it is C the PCR products can be digested. M: 100 bp DNA ladder.

2.3 功能標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

用的分子標(biāo)記SNP-A-1、SNP-A-2、SNP-B-1、SNP-B-2、SNP-D-1和SNP-D-2對(duì)PA進(jìn)行基因型掃描, 對(duì)PA在7個(gè)年點(diǎn), 30種環(huán)境下的表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示, 只有來(lái)自-的標(biāo)記SNP-D-1和SNP-D-2分別與穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)有顯著關(guān)聯(lián)(表2), 其余標(biāo)記與表型性狀之間無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。

表2 TaNAC67-6D標(biāo)記SNP-D-1、SNP-D-2與農(nóng)藝性狀相關(guān)性

SY: 順義; CP: 昌平; DS: 旱處理; HS: 熱處理; WW: 正常灌溉; SL: 穗長(zhǎng); TNSS: 每穗小穗數(shù)。n.s., 未達(dá)到-value為0.05的顯著水平;*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。

SY: Shunyi; CP: Changping; DS: drought stress; HS: heat stress; WW: well-watered; SL: spike length; TNSS: total number of spikelet per spike. n.s., not significant;*,**,***represent significant at the 0.05, 0.01, 0.001 probability levels, respectively.

關(guān)聯(lián)分析表明, 標(biāo)記SNP-D-1在30種環(huán)境條件下, 即9種水地、9種旱地、6種水熱和6種旱熱環(huán)境條件下, 均與穗長(zhǎng)(spike length, SL)呈顯著或極顯著相關(guān)。標(biāo)記SNP-D-2在20種環(huán)境條件下, 即7種水地、7種旱地、3種水熱和3種旱熱環(huán)境下, 與每穗小穗數(shù)(total number spikelet per spike, TNSS)呈顯著或極顯著相關(guān)(表2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 在PA群體中, 標(biāo)記SNP-D-1位點(diǎn)基因型是T的材料穗長(zhǎng)顯著或極顯著高于基因型為G的材料(圖4-A), 標(biāo)記SNP-D-2位點(diǎn)基因型為C的材料每穗小穗數(shù)顯著或極顯著高于基因型是T的材料(圖4-B)。因此推測(cè), 標(biāo)記SNP-D-1-T是增加穗長(zhǎng)的優(yōu)異等位變異, 標(biāo)記SNP-D-2-C是增加每穗小穗數(shù)的優(yōu)異等位變異。

圖4 30種環(huán)境下標(biāo)記SNP-D-1和SNP-D-2兩種基因型的表型比較

30種環(huán)境條件下標(biāo)記SNP-D-1 (A)和SNP-D-2 (B)兩種基因型穗長(zhǎng)(A)和每穗小穗數(shù)(B)比較。*、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。

Comparisons of spike length (A) and total number of spikelet per spike (B) for two genotypes of SNP-D-1 (A) and SNP-D-2 (B) under 30 environmental conditions. *, **, *** represent significant at the 0.05, 0.01, 0.001 probability levels, respectively.

2.4 TaNAC67-6D單倍型與農(nóng)藝性狀的關(guān)系

標(biāo)記掃描發(fā)現(xiàn), 在PA群體中存在4種單倍型, 即-6D-1、-6D-2、-6D-3和-6D-4 (圖3-A), 其所占比例分別是12.13%、63.24%、22.43%和2.21%。由于-6D-4所占比例小于5%, 為稀有單倍型, 因此在后續(xù)分析中不再考慮。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 除E2環(huán)境條件外, 29種環(huán)境條件下單倍型為-6D-3材料穗長(zhǎng)均顯著高于-6D-2的穗長(zhǎng); 在9種環(huán)境條件下(E6-E10、E13、E16、E27、E29),-6D-3的穗長(zhǎng)顯著高于-6D-1 (圖5-A)。在18種環(huán)境條件下(E2-E4、E7-E13、E15-E17、E22、E25-E27、E29),-6D-3的每穗小穗數(shù)顯著高于-6D-1, 而-6D-3與-6D-2之間沒(méi)有顯著差異(圖5-B)。綜上所述,-6D-3既能增加小麥穗長(zhǎng), 又能增加每穗小穗數(shù), 因此是控制穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)的優(yōu)異單倍型。

2.5 TaNAC67-6D單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的地理分布

根據(jù)地域氣候特征、地勢(shì)地形、栽培特點(diǎn)和播種、成熟期早晚等, 我國(guó)的小麥種植區(qū)劃分為10個(gè)主要生態(tài)區(qū)域, 即北部冬麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、西南冬麥區(qū)、華南冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)、北部春麥區(qū)、西北春麥區(qū)、青藏春-冬麥區(qū)和新疆冬-春麥區(qū)[34]。為了研究-三種單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的分布特點(diǎn), 分別分析了農(nóng)家品種群體(PL)和育成品種群體(PM)材料的單倍型。在PL中僅檢測(cè)到兩種單倍型, 即-6D-2和-6D-3。在黃淮冬麥區(qū)(II)、西北春麥區(qū)(VIII)、青藏春-冬麥區(qū)(IX)和西南冬麥區(qū)(IV)等4個(gè)麥區(qū)農(nóng)家品種中只檢測(cè)到-6D-2; 在其他6個(gè)麥區(qū)中-6D-2比例也均超過(guò)80%, 因此在農(nóng)家品種中,-6D-2是優(yōu)勢(shì)單倍型(圖6-A)。在PM中存在3種單倍型, 但是在青藏春-冬麥區(qū)(IX)中只檢測(cè)到-6D-2, 在西南冬麥區(qū)(IV)和華南冬麥區(qū)(V)檢測(cè)到-6D-2和-6D-3兩種單倍型。與PL相比,-6D-3在PM的比例明顯增加, 其中西南冬麥區(qū)(IV)中單倍型-6D-3從0增加到7.89%, 華南冬麥區(qū)(V)中從16.67%增加到28.57%。在其余的7個(gè)麥區(qū)中均存在3種單倍型, 其中-6D-1在東北春麥區(qū)(VI)和新疆冬-春麥區(qū)(X)兩大麥區(qū)中比例顯著上升, 分別從無(wú)各增加了20%和11.11%。在北部冬麥區(qū)(I)、北部春麥區(qū)(VII)、黃淮冬麥區(qū)(II)和長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(III),-6D-3的頻率也呈明顯上升趨勢(shì)。由圖6可以看出, 從農(nóng)家品種到現(xiàn)代育成種,-6D-1和-6D-3的頻率呈上升趨勢(shì), 說(shuō)明這兩種單倍型在育種中受到了選擇。

圖5 30種環(huán)境條件下TaNAC67-6D三種單倍型表型比較

在30種環(huán)境條件下3種單倍型穗長(zhǎng)(A)和每穗小穗數(shù)(B)比較。不同的小寫字母表示0.05水平下差異的顯著性。

Comparisons of spike length (A) and total number of spikelet per spike (B) for three haplotypes ofunder 30 environments. Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

圖6 TaNAC67-6D單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的地理分布

-三個(gè)單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)農(nóng)家品種(A)和育成品種(B)群體中的分布。I: 北方冬麥區(qū); II: 黃淮冬麥區(qū); III: 長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū); IV: 西南冬麥區(qū); V: 南方冬麥區(qū); VI: 東北春麥區(qū); VII: 北方春麥區(qū); VIII: 西北春麥區(qū); IX: 青-藏冬春麥區(qū); X: 新疆冬春麥區(qū)。

Haplotype distributions of-in landrace (A) and modern variety (B) populations. I: Northern Winter Wheat Zone; II: Yellow and Huai River Valleys Facultative Wheat Zone; III: Middle and Low Yangtze Valleys Autumn-Sown Spring Wheat Zone; IV: Southwestern Autumn-Sown Spring Wheat Zone; V: Southern Autumn-Sown Spring Wheat Zone; VI: Northeastern Spring Wheat Zone; VII: Northern Spring Wheat Zone; VIII: Northwestern Spring Wheat Zone; IX: Qinghai-Tibetan Plateau Spring-Winter Wheat Zone; X: Xinjiang Winter-Spring Wheat Zone.

2.6 轉(zhuǎn)基因水稻穗部表型及其與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的關(guān)系

對(duì)野生型和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系(L1和L2)成熟期穗部性狀測(cè)定分析發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因水稻主穗長(zhǎng)顯著大于野生型對(duì)照(圖7-A, B)。同時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻主穗的一級(jí)分枝和二級(jí)分枝(圖7-C)、主穗穗粒數(shù)(圖7-D)均顯著高于野生型, 雖然秕粒數(shù)也顯著高于野生型(圖7-E), 但最終飽滿籽粒數(shù)仍顯著高于野生型對(duì)照; 轉(zhuǎn)基因水稻的千粒重與野生型之間沒(méi)有顯著差異(圖7-F)。

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子超家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族, 在植物體廣泛存在。在玉米[35]、水稻[7]、馬鈴薯[36]、小麥[37]等均超過(guò)100個(gè)成員, 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮著極其重要的作用。前人研究發(fā)現(xiàn), 過(guò)表達(dá)能改變水稻根系結(jié)構(gòu), 并提高籽粒產(chǎn)量[10];和激活細(xì)胞程序性死亡相關(guān)基因表達(dá), 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[38];參與抑制水稻開花[39]。、-過(guò)表達(dá)不僅可增加小麥根長(zhǎng), 還提高產(chǎn)量或生物量[14-15]。本研究采用關(guān)聯(lián)分析方法, 發(fā)現(xiàn)參與控制小麥的穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù), 并通過(guò)轉(zhuǎn)化水稻進(jìn)一步證明上述結(jié)果, 說(shuō)明在控制重要農(nóng)藝性狀發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。

圖7 轉(zhuǎn)基因水稻穗部性狀比較

轉(zhuǎn)基因水稻穗部特征(A)及轉(zhuǎn)基因水稻(L1、L2)與野生型(WT)主穗的穗長(zhǎng)(B)、穗分枝(C)、千粒重(TGW)(D)、穗粒數(shù)(E)和空粒數(shù)(F)比較。**表示在0.01概率水平差異顯著。

Comparisons of panicle traits between transgenic rice (L1, L2) and WT in panicle phenotype (A), panicle length (B), panicle branch (C), grain number per panicle (D), sterile grain number per panicle (E), and thousand grain weight (TGW) (F). ** Significant at the 0.01 probability level.

本研究克隆了包括上游啟動(dòng)子區(qū)和基因編碼區(qū)的基因組序列-、-、-, 并通過(guò)直接測(cè)序檢測(cè)其DNA序列多態(tài)性, 發(fā)現(xiàn)的3個(gè)拷貝均存在序列多態(tài)性, 其中-、-多態(tài)性位點(diǎn)均位于啟動(dòng)子區(qū), 而-啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)均存在SNP。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)-、-的4個(gè)標(biāo)記SNP-A-1、SNP-A-2、SNP-B-1、SNP-B-2與所檢測(cè)的農(nóng)藝性狀沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián), 推測(cè)雖然這些變異位于啟動(dòng)子區(qū), 但其對(duì)基因的表達(dá)可能影響不大, 因此與考察的性狀沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián), 后期還需要對(duì)此進(jìn)一步深入研究。位于-編碼區(qū)357 nt的SNP位點(diǎn)正好處于密碼子的第3位, 其2種基因型均未導(dǎo)致氨基酸變異, 屬于典型的同義突變, 說(shuō)明在結(jié)構(gòu)上很保守, 也暗示了其功能的重要性。

有研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)能增加轉(zhuǎn)基因水稻的穗數(shù), 同時(shí)提高灌漿速率[11],過(guò)表達(dá)能夠增加水稻小穗數(shù)[12]。我們通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),-的2個(gè)SNP位點(diǎn)分別與穗長(zhǎng)和每穗小穗數(shù)顯著相關(guān), 而轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明過(guò)表達(dá)能增加水稻的穗長(zhǎng)和穗分枝數(shù), 同時(shí)穗粒數(shù)也有顯著提高, 進(jìn)一步驗(yàn)證了關(guān)聯(lián)分析結(jié)果, 這一方面說(shuō)明NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控小麥、水稻等農(nóng)作物的穗部性狀, 另一方面也說(shuō)明-的2個(gè)功能標(biāo)記可以用于穗部性狀的選擇。在PA中共檢測(cè)到4種單倍型, 其中-6D-4為稀有單倍型, 未做進(jìn)一步分析。對(duì)前3種單倍型材料的方差分析發(fā)現(xiàn), 不同單倍型材料的穗長(zhǎng)變化趨勢(shì)明顯, 即-6D-3＞-6D-1＞-6D-2, 且不同單倍型每穗小穗數(shù)變化趨勢(shì)與穗長(zhǎng)分析結(jié)果基本吻合, 因此認(rèn)為-6D-3是增加穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)的最優(yōu)單倍型。從3種單倍型在我國(guó)十大麥區(qū)的地理分布來(lái)看,-6D-2在黃淮冬麥區(qū)(II)、西北春麥區(qū)(VIII)、青藏春-冬麥區(qū)(IX)和西南冬麥區(qū)(IV) 農(nóng)家品種中為主要單倍型, 所占比例達(dá)到了100%, 同時(shí)在其他幾個(gè)麥區(qū)的比例也超過(guò)了80% (圖6-A), 從一個(gè)側(cè)面反映了-6D-1和- 6D-3可能是比較新的單倍型。在現(xiàn)代育成品種中, 除育種工作較弱的青藏春冬麥區(qū)(IX)外, 其他各區(qū)均檢出-6D-1和/或-6D-3, 同時(shí)二者所占的比例也較農(nóng)家品種有所提升(圖6-B), 說(shuō)明二者在我國(guó)小麥育種中受到了正向選擇。

比較-6D-1和-6D-3, 二者對(duì)穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)均有正向貢獻(xiàn), 但是-6D-3的貢獻(xiàn)更大。與此一致, 在絕大多數(shù)麥區(qū)的育成品種中-6D-3所占的比例也相對(duì)較大, 這在一定程度上反映了育種家對(duì)大穗多粒性狀的關(guān)注。不過(guò), 最優(yōu)單倍型-6D-3在各大麥區(qū)中所占的比例仍然較低, 因此還有很大的提升利用空間。轉(zhuǎn)基因水稻的表型也驗(yàn)證了小麥關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果。因此認(rèn)為可以用于改良穗部性狀, 本研究開發(fā)的-分子標(biāo)記可用于小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種。

4 結(jié)論

小麥基因-、-、-的多態(tài)性多數(shù)位于啟動(dòng)子區(qū), 其編碼區(qū)相對(duì)保守。在小麥自然群體中,-存在3種主要單倍型, 其中-6D-3是增加穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)的優(yōu)異單倍型, 在我國(guó)小麥育種中受到了正向選擇?？梢杂糜诟牧嫁r(nóng)作物的穗部性狀, 其功能標(biāo)記SNP-D-1和SNP-D-2將有利于小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種。

[1] Huang Q, Wang Y, Li B, Chang J, Chen M, Li K, Yang G, He G. TaNAC29, a NAC transcription factor from wheat, enhances salt and drought tolerance in transgenic., 2015, 15: 268.

[2] Jin C, Li K Q, Xu X Y, Zhang H P, Chen H X, Chen Y H, Hao J, Wang Y, Huang X S, Zhang S L. A novel NAC transcription factor, PbeNAC1, ofconfers cold and drought tole-rance via interacting with PbeDREBs and activating the expression of stress-responsive genes., 2017, 8: 1049.

[3] Hu H, You J, Fang Y, Zhu X, Qi Z, Xiong L. Characterization of transcription factor geneconferring cold and salt tolerance in rice., 2010, 72: 567–568.

[4] Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M. Genes involved in organ separation in: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant., 1997, 9: 841–857.

[5] Taoka K, Yanagimoto Y, Daimon Y, Hibara K, Aida M, Tasaka M. The NAC domain mediates functional specificity of cup-shaped cotyledon proteins., 2004, 40: 462.

[6] Nakashima K, Tran L S, Van Nguyen D, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice., 2007, 51: 617–630.

[7] Nuruzzaman M, Manimekalai R, Sharoni A M, Satoh K, Kondoh H, Ooka H, Kikuchi S. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice., 2010, 465: 30–44.

[8] Souer E, van Houwelingen Adèle, Kloos D, Mol J, Koes R. Kloos The no apical meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries., 1996, 85: 159–170.

[9] Chen X, Cheng J, Chen L, Zhang G, Huang H, Zhang Y, Xu L. Auxin-independent NAC pathway acts in response to explant- specific wounding and promotes root tip emergence during de novo root organogenesis in., 2016, 170: 2136–2145.

[10] Redillas M C, Jeong J S, Kim Y S, Jung H, Bang S W, Choi Y D, Ha S H, Reuzeau C, Kim J K. The overexpression ofalters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions., 2012, 10: 792–805.

[11] Shim J S, Oh N, Chung P J, Kim Y S, Choi Y D, Kim J K. Overexpression ofimproves drought tolerance in rice., 2018, 9: 310.

[12] Lee D K, Chung P J, Jeong J S, Jang G, Bang S W, Jung H, Kim Y S, Ha S H, Choi Y D, Kim J K. The rice OsNAC6 transcription factor orchestrates multiple molecular mechanisms involving root structural adaptions and nicotianamine biosynthesis for drought tolerance., 2017, 15: 754–764.

[13] Li J, Guo G H, Guo W W, Guo G G, Tong D, Ni Z F, Sun Q X, Yao Y Y. miRNA164-directed cleavage of ZmNAC1 confers lateral root development in maize (L.)., 2012, 12: 220.

[14] Chen D D, Chai S C, Mcintyre C L, Xue G P. Overexpression of a predominantly root-expressed NAC transcription factor in wheat roots enhances root length, biomass and drought tolerance., 2018, 37: 225–237.

[15] Chen D, Richardson T, Chai S, Lynne Mcintyre C, Rae A L, Xue G P. Drought-up-regulated TaNAC69-1 is a transcriptional re-pressor ofand, and enhances root length and biomass in wheat., 2016, 57: 2076–2090.

[16] Li W, Li X X, Chao J T, Zhang Z L, Wang W F, Guo Y F. NAC family transcription factors in tobacco and their potential role in regulating leaf senescence., 2018, 9: 1900

[17] Zhao F L, Ma J H, Li L B, Fan S L, Guo Y N, Song M Z, Wei H L, Pang C Y, Yu S X., a neutral candidate gene, leads to early aging in cotton (L.)., 2015, 576: 268–274.

[18] Ren T T, Wang J W, Zhao M M, Gong X M, Wang S X, Wang G, Zhou C J. Involvement of NAC transcription factor SiNAC1 in a positive feedback loop via ABA biosynthesis and leaf senescence in foxtail millet., 2017, 247: 1–16.

[19] El Mannai Y, Akabane K, Hiratsu K, Satoh-Nagasawa N, Wabiko H. The NAC transcription factor gene() promotes leaf senescence and accelerates heading time in rice., 2017, 18: 2165.

[20] Christiansen M W, Matthewman C, Podzimska-Sroka D, O’Shea C, Lindemose S, Mollegaard N E, Holme I B, Hebelstrup K, Skriver K, Gregersen P L. Barley plants over-expressing the NAC transcription factor geneshow stunting and delay in development combined with early senescence., 2016, 67: 5259–5273.

[21] Collinge M, Boller T. Differential induction of two potato genes,and, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding., 2001, 46: 521–529.

[22] Xia N, Zhang G, Liu X Y, Deng L, Cai G L, Zhang Y, Wang X J, Zhao J, Huang L L, Kang Z S. Characterization of a novel wheat NAC transcription factor gene involved in defense response against stripe rust pathogen infection and abiotic stresses., 2010, 37: 3703–3712.

[23] Wang B, Wei J, Song N, Wang N, Zhao J, Kang Z S. A novel wheat NAC transcription factor, TaNAC30, negatively regulates resistance of wheat to stripe rust., 2018, 60: 432–443.

[24] Wang Z, Xia Y, Lin S, Wang Y, Guo B, Song X, Ding S, Zheng L, Feng R, Chen S, Bao Y, Sheng C, Zhang X, Wu J, Niu D, Jin H, Zhao H. Osa-miR164a targetsand negatively regulates rice immunity against the blast fungus., 2018, 95: 584–597.

[25] Liu Q, Yan S J, Huang W J, Yang J Y, Dong J F, Zhang S H, Zhao J L, Yang T F, Mao X X, Zhu X Y. NAC transcription factor ONAC066 positively regulates disease resistance by suppressing the ABA signaling pathway in rice., 2018, 98: 289–302.

[26] Mao C, Ding J, Zhang B, Xi D, Ming F. OsNAC2 positively affects salt-induced cell death and binds to theandpromoters., 2018, 94: 454–468.

[27] Shen J, Lü B, Luo L, He J, Mao C, Xi D, Ming F. The NAC-type transcription factor OsNAC2 regulates ABA-dependent genes and abiotic stress tolerance in rice., 2017, 7: 40641.

[28] Chung P J, Jung H, Choi Y D, Kim J K. Genome-wide analyses of direct target genes of four rice NAC-domain transcription factors involved in drought tolerance., 2018, 19: 40.

[29] 盧敏, 張登峰, 石云素, 宋燕春, 黎裕, 王天宇. 玉米脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39: 2177–2182.Lu M, Zhang D F, Shi Y S, Song Y C, Li Y, Wang T Y. Overexpression of a stress induced maize NAC transcription factor gene,, improved drought and salt tolerance in., 2013, 39: 2177–2182 (in Chinese with English abstract).

[30] Mao H, Yu L, Han R, Li Z, Liu H. ZmNAC55, a maize stress-responsive NAC transcription factor, confers drought resistance in transgenic., 2016, 105: 55–66.

[31] Xia N, Zhang G, Yan F, Zhu L, Xu L S, Chen X M, Liu B O., a novel NAC transcription factor gene in wheat, responds to stripe rust pathogen infection and abiotic stresses., 2010, 74: 394–402.

[32] Mao X G, Zhang H Y, Qian X Y, Li A, Zhao G Y, Jing R L. TaNAC2, a NAC-type wheat transcription factor conferring enhanced multiple abiotic stress tolerances in., 2012, 63: 2933–2946.

[33] Mao X G, Chen S S, Li A, Zhai C C, Jing R L. Novel NAC transcription factor TaNAC67 confers enhanced multi-abiotic stress tolerances in., 2014, 9: e84359.

[34] 金善寶. 中國(guó)小麥學(xué). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1996. pp 95–124. Jin S B. Chinese Wheat. Beijing: China Agriculture Press, 1996. pp 95–124 (in Chinese).

[35] Shiriga K, Sharma R, Kumar K, Yadav S K, Hossain F, Thirunavukkarasu N. Genome-wide identification and expression pattern of drought-responsive members of the NAC family in maize., 2014, 2: 407–417.

[36] Singh A K, Sharma V, Pal A K, Acharya V, Ahuja P S. Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato (L.)., 2013, 20: 403–423.

[37] Borrill P, Harrington S A, Uauy C. Genome-wide sequence and expression analysis of the NAC transcription factor family in polyploid wheat.:, 2017, 7: 3019–3029.

[38] Huysmans M, Buono R A, Skorzinski N, Radio M C, De Winter F, Parizot B, Mertens J, Karimi M, Fendrych M, Nowack M K. NAC transcription factors ANAC087 and ANAC046 control distinct aspects of programmed cell death in the Arabidopsis columella and lateral root cap., 2018, 30: 2197–2213.

[39] Guo S, Dai S, Singh P K, Wang H, Wang Y, Tan J L H, Wee W, Ito T. A membrane-bound NAC-like transcription factor OsNTL5 represses the flowering in., 2018, 9: 555.

Transcription factor geneinvolved in regulation spike length and spikelet number per spike in common wheat

ZHANG Hong-Juan1,2, LI Yu-Ying2,3, MIAO Li-Li2, WANG Jing-Yi2, LI Chao-Nan2, YANG De-Long1,*, MAO Xin-Guo1,2,*, and JING Rui-Lian2

1College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China;3College of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

NAC transcription factor is a plant specific superfamily and plays an essential role in regulating plant growth and development and stress response. Our previous research indicated thatinvolved in the response to various environmental stimuli and its overexpression resulted in enhanced tolerance to multiple abiotic stresses. To probe its roles in plant growth and development, a panel consisted of 36 wheat accessions with high diversity we need for polymorphism assays. The genomic sequences, covering the promoter region and gene coding region, were obtained by Sanger sequencing, and named as-,-, and-according to their genomic origins. For-,a SNP (A/G) at –1516 nt and a 126 bp InDel between –873 and –748 nt were identified in the promoter region, and one CAPS and one allele specific marker were developed, respectively. For, two SNPs, at –2014 and –1916 nt were detected, and two dCAPS markers were developed accordingly. For-, two SNPs, one at –1795 nt in the promoter region, and the other at 357 nt in the gene coding region were identified, and one CAPS and one dCAPS marker were designed, respectively. To probe the relationship of molecular markers and potential agronomic traits, we introduced a population (PA) with 282 common wheat accessions to perform association assay. No association was identified between markers from-andand agronomic traits. However, strong associations were identified between SNP-D-1and spike length (SL), and between SNP-D-2 and the total number of spikelet per spike (TNSS). Haplotype assays showed there were three major haplotypes in PA, i.e.-6D-1, -2, -3. Furthermore, the SL of accessions with-6D-3 was significant longer than that with the other two haplotypes under all 30 environments, and the TNSS was significant larger under 22 environments, thus-6D-3 is an elite haplotype for both SL and TNSS, which was selected positively in the process of wheat breeding in China. Further transgenic experiments revealed that-rice lines had lager panicles and more seeds relative to wild type, which is consistent with the association assay results. Therefore,is a potential candidate gene in spike traits improvement, and-might be used in marker assistant molecular breeding in wheat.

wheat;transcription factor; single nucleotide polymorphism; functional marker; haplotype; association assay

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0300202)和甘肅省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(GARS-01-04)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Plan (2017YFD0300202) and Gansu Agriculture Research System (GARS-01-04).

楊德龍, E-mail: yangdl@gsau.edu.cn, Tel: 0931-7631742; 毛新國(guó), E-mail: maoxinguo@caas.cn, Tel: 010-82105829

E-mail: 1412360690@qq.com

2019-01-23;

2019-05-12;

2019-05-22.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190521.1451.006.html

10.3724/SP.J.1006.2019.91009