血液分離肺炎克雷伯菌毒力基因與耐藥性研究

趙金云 許文芳 金法祥

(紹興市立醫(yī)院檢驗科，紹興 312000)

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性感染及社區(qū)獲得性感染中常見的條件致病菌，在由革蘭陰性菌引起的血流感染中，其分離率僅次于大腸埃希菌，位居第二[1]。20世紀80年代中期到90年代，出現(xiàn)了高黏液性肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae, HmKP)，與傳統(tǒng)肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiella pneumoniae, cKP)相比，高黏液性肺炎克雷伯菌具高表達莢膜的特性，其典型的臨床意義是導致化膿性肝膿腫、腦膜炎、眼內(nèi)炎等重癥感染，經(jīng)常引發(fā)播散性感染，病死率高達30%，嚴重危及人類生命健康[2-3]。本研究旨在比較分析血液標本分離的高黏液性和非高黏液性肺炎克雷伯菌的毒力基因、耐藥性特點以及相關(guān)臨床特征，為加強臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集本院2015年1月—2016年12月血流感染分離的非重復肺炎克雷伯菌144株。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌 ATCC700603。

1.2 標本處理

抽取患者20mL血液分別注入需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶中，放入BacT/Alert 3D全自動血培養(yǎng)儀，待陽性時轉(zhuǎn)種于血平皿，培養(yǎng)16～18h后，采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定分析儀進行鑒定。

1.3 拉絲試驗

用接菌環(huán)沾取血平皿上的單個菌落，將接菌環(huán)向上提起，拉絲長度大于0.5cm判定為黏液性菌株，拉絲長度≤0.5cm為非黏液性菌株。

1.4 藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法(KB法)，結(jié)果按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 2016年版推薦的方法進行判定。

1.5 毒力基因檢測

根據(jù)文獻資料設計相關(guān)毒力基因引物，包括莢膜血清型(K1、K2、K54和K57)、rmpA、黏附因子(MrkD)、鐵載體相關(guān)基因(icuA、iroN和ybtS)、kfu和allS，采用聚合酶鏈反應(PCR)進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，高黏液性和非黏液性細菌的組間差異采用χ2檢驗，P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血流感染分離肺炎克雷伯菌的分子特征

收集的144株肺炎克雷伯菌中，高黏液性菌株共31株(21.53%)，以K1、K2型多見；高黏液性菌株均含有rmpA、mrkD和icuA基因，除mrkD和kfu基因外，其他基因在高黏液性菌株中的比例均顯著高于非黏液性菌株(P＜0.01)，如表1所示。

表1 血液分離肺炎克雷伯菌的分子特征Tab.1 Molecular characteristics of Klebsiella pneumoniae isolated from blood

2.2 血流感染分離肺炎克雷伯菌對抗菌藥物耐藥性

分離菌株對測定抗菌藥物的耐藥性如表2所示，高黏液性菌株除了對氨芐西林的耐藥性為100%外，對其他藥物的耐藥性均低于20.00%，而非黏液性菌株對抗菌藥物的耐藥性均高于黏液性菌株，尤其是頭孢菌素類、亞胺培南和環(huán)丙沙星，具有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 肺炎克雷伯菌敗血癥患者的臨床特征

肺炎克雷伯菌引起的血流感染患者的臨床資料如表3所示，87.10%的高黏液性菌株來自男性患者，而非黏液性菌株中，有59.29%為男性患者；與非黏液性菌株相比，高黏液性菌株血流感染更容易引起肝膿腫(P＜0.05)；而兩種細菌在致死率方面并無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

表2 血液分離肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥性Tab.2 Antibacterial drugs resistance of Klebsiella pneumoniae isolated from blood

表3 肺炎克雷伯菌敗血癥患者的臨床特征Tab.3 Clinical characteristics of patients with septicemia caused by Klebsiella pneumoniae

3 討論

肺炎克雷伯菌所致感染存在明顯的地域差異，感染主要發(fā)生在中國臺灣、韓國等亞洲和太平洋沿岸地區(qū)，在我國，肺炎克雷伯菌也是院內(nèi)感染及社區(qū)感染最主要的病原菌之一[4]。近年來致病性較強的高黏液表型肺炎克雷伯菌不斷出現(xiàn)，逐漸引起人們的關(guān)注。

莢膜多糖是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子。依據(jù)莢膜多糖抗原性的不同可分為至少78種血清型，中國臺灣研究人員發(fā)現(xiàn)，K1、K2型肺炎克雷伯菌具顯著表達莢膜特性，能抵抗白細胞的吞噬能力，致病性較強，與肺炎克雷伯菌引起菌血癥及肝膿腫等重癥感染癥密切相關(guān)[5]。本次研究中，通過拉絲試驗共篩選出31株高黏液性肺炎克雷伯菌，其中70.00%為K1、K2型，顯著高于非黏液性菌株(P＜0.01)，但非黏液性菌株中也檢測到了K1、K2基因型，因此，莢膜基因型不能作為篩選高黏液性肺炎克雷伯菌金標準。rmpA基因是肺炎克雷伯菌高黏液特性相關(guān)的毒力因子，可通過質(zhì)粒和染色體介導，調(diào)控莢膜多糖的過度產(chǎn)生，增強細菌在體外和體內(nèi)的抗吞噬活性[6]，本研究中，所有高黏液性菌株均含有rmpA基因，且顯著高于非黏液型菌株(P＜0.01)；鐵載體(siderophores)是肺炎克雷伯菌分泌的一種攝取鐵的低分子量化合物，是另一種重要的毒力因子，其特點是對鐵有高度親和力，可以在環(huán)境中攝取微量游離的鐵或者直接螯合哺乳動物載體蛋白中的鐵，參與細菌生長和代謝[7-8]，iucA、iroN、ybtS作為肺炎克雷伯菌鐵載體相關(guān)基因，超過70.00%的高黏液性菌株含有這些基因，顯著高于非黏液型菌株(P＜0.01)，這與Shon等[3]報道一致；mrkD基因是肺炎克雷伯菌的黏附因子，可調(diào)節(jié)肺炎克雷伯菌在肺和腎臟細胞表面的附著，還可促進細菌與細胞的相互作用[9]，94.44%(136/144)的菌株含有此基因，但mrkD基因在高黏液性和非黏液性肺炎克雷伯菌中的含量并無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

本研究中，分離所得的31株高黏液性肺炎克雷伯菌除對氨芐西林的耐藥率達到100.00%(天然耐藥)，對其余測定的抗菌藥物的耐藥率均較低，未發(fā)現(xiàn)對碳青酶烯類耐藥的高黏液性肺炎克雷伯菌，這與其他研究結(jié)果類似，但如表3所示，也出現(xiàn)了個別對氨芐西林以外抗菌藥物耐藥的高黏液性菌株，Li等[10]報道具有高耐藥性、高毒力肺炎克雷伯菌的比例在逐漸增長，因此監(jiān)測這類菌株的抗菌藥物耐藥性實屬必要。

本次研究收集的菌株大部分來自男性患者，高黏液性和非黏液性肺炎克雷伯菌引起的菌血癥在不同性別患者方面有一定的差異，但此差異是否具有普遍性還需加大樣本量進行進一步研究。本研究以60歲(＞60歲視為老年患者)為分界線，發(fā)現(xiàn)高黏液性和非黏液性菌株所引發(fā)的菌血癥以老年人較多，但在年齡方面兩者并無明顯差異。通過對患者的臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，高黏液性肺炎克雷伯菌菌血癥更易引發(fā)肝膿腫等遷徙病灶。自1982年我國首次報道肺炎克雷伯菌肝膿腫(KPLA)，患KPLA的病例報道和研究越來越多，有研究顯示，由肺炎克雷伯菌引起的細菌性肝膿腫高達80%，而近來研究發(fā)現(xiàn)，導致細菌性肝膿腫的肺炎克雷伯菌多數(shù)黏液絲試驗陽性，具有高黏液表型[11-12]。對高黏液性和非黏液性肺炎克雷伯菌引起的菌血癥患者的病死率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，兩類肺炎克雷伯菌引起的病死率均在10.00%左右，無統(tǒng)計學差異，可能是因為高黏液性菌株雖然毒力較強，但藥物耐藥率低，而非黏液性菌株雖然藥物耐藥率較高，但毒力較弱，近年來由于國家對抗菌藥物的有力監(jiān)管，經(jīng)過合理的治療，患者病死率得到了一定控制。

綜上所述，本次研究的肺炎克雷伯菌菌血癥中，高黏液性肺炎克雷伯菌占有一定比例，且以K1、K2型多見，相對于非黏液性肺炎克雷伯菌，高黏液性菌株血流感染更易引起肝膿腫等遷徙病灶，由于含有更多的毒力基因，高黏液性菌株毒性更強，但藥物敏感性較高，應加強對具有高耐藥性的高黏液性肺炎克雷伯菌的監(jiān)控。