加米霉素注射液在豬體內(nèi)殘留消除研究

鄧菲 段鵬 孫曉蒙

(華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司，石家莊 050041)

加米霉素(gamithromycin)屬氮雜內(nèi)酯類抗生素，是由法國梅里亞((MERIAL)公司研發(fā)的最新動物專用大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素[1]。2008年，加米霉素注射液首次在歐盟被批準(zhǔn)用于治療溶血曼氏菌、多殺巴氏菌、睡眠嗜組織菌等引起牛呼吸系統(tǒng)疾病(BRD)。

為了打破國外對國內(nèi)加米霉素的壟斷地位，華北制藥集團(tuán)動保公司成功仿制出加米霉素注射液，經(jīng)過大量的試驗(yàn)研究證明，本產(chǎn)品除了可以治療牛的BRD外，也可以防治由胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血菌及鏈球菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病(SRD)，其在靶動物體內(nèi)具有吸收快、分布廣、安全高效、殘留低等特點(diǎn)[2-6]。為了更深一步了解國產(chǎn)加米霉素注射液在豬體內(nèi)殘留時間。因此，本試驗(yàn)旨在通過對豬注射加米霉素，探討其在豬體內(nèi)的殘留消除時間，以期為科學(xué)制定休藥期，指導(dǎo)合理臨床用藥，保障動物源性食品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品與試劑

加米霉素注射液，含量150mg/mL，批號：GMM03-1-GMM2，由華北制藥集團(tuán)動物保健品有限責(zé)任公司提供；加米霉素對照品(加拿大TRC公司，含量≥99.0%)；加米霉素-D5對照品(加拿大TRC公司，含量≥94.0%)；乙腈、甲醇、甲酸為色譜級(德國Merck公司)；MCX固相萃取柱(Waters公司，60mg3/mL)。

1.2 儀器和設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國Waters公司)；BS-201S型電子天平(北京賽多利斯公司)；DC12H型氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；3K30型低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；WH-3型微型旋渦混勻儀(上海滬西分析儀器廠)；24通道固相萃取裝置(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 主要試液配制

加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(50μg/mL)：精密稱取加米霉素對照品2.5mg，于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻即得(-20℃保存)。

加米霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液(10μg/mL)：精密量取50μg/mL的加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液20mL，于100mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻即得(4℃保存)。

加米霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10μg/mL)：精密稱取加米霉素-D5對照品1mg，于100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻即得(-20℃保存)。

加米霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液(1μg/mL)：精密量取10μg/mL的加米霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液10mL，于100mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻即得(4℃保存)。

1.4 試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)實(shí)施時間為2016年9月10日—2016年10月14日，試驗(yàn)場地為南京市某豬場。選取體質(zhì)健康，體重(60±4.3)kg，并在試驗(yàn)前2周未使用抗生素治療的28頭二元豬(雌雄各半)，隨機(jī)分為2組，對照組4頭，試驗(yàn)組24頭。試驗(yàn)組豬單次頸部肌注射加米霉素(6mg/kg B.W.以加米霉素計(jì))，對照組不做處理，試驗(yàn)期35d。各組常規(guī)飼養(yǎng)并飼喂相同日糧及飲水。

1.5 樣品采集及處理

豬注射后，分別在第0.5天、7天、14天、21天、28天和35天時，采集肌肉、肝臟、腎臟、皮脂及注射部位肌肉。對照組豬在試驗(yàn)7d時宰殺；各時間段，隨機(jī)剖殺4頭試驗(yàn)豬進(jìn)行采樣。收集的組織保存于-20℃冰箱中，待測加米霉素殘留指標(biāo)[7]。

1.6 試驗(yàn)方法

加米霉素在豬體內(nèi)殘留含量檢測方法[8]，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理，數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，并采用WT 1.4休藥期軟件處理藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，計(jì)算休藥期[9]。

2 結(jié)果

2.1 檢測方法有效性

加米霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線在2～500μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其曲線方程為：Y=1.11256X-0.208095，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。該方法各組織最低檢測限為2μg/kg；所有組織定量限為5μg/kg。各組織回收率為73%～114%，批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于14.03%。藥物回收率及變異系數(shù)符合農(nóng)業(yè)部相關(guān)規(guī)定[10]，表明該方法能夠滿足加米霉素殘留消除規(guī)律試驗(yàn)要求。

圖1 加米霉素及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.1 Characteristic ion mass chromatogram of gamithromycin and internal standard solution

圖2 豬腎臟空白特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.2 Mass chromatogram of porcine kidney

圖3 豬腎臟空白添加加米霉素及內(nèi)標(biāo)特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.3 Chromatogram of characteristic ion for adding gamithromycin and internal standard in swine kidney blank

由圖1～3可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、空白組織以及空白組織添加加米霉素色譜圖對照相比發(fā)現(xiàn)，待測物在保留時間處無干擾，方法專屬性良好。

2.2 組織中藥物殘留

由表1可知。豬注射加米霉素后，在0.5d時，各個組織均達(dá)到最大殘留含量，除注射部位肌肉組織外，加米霉素在腎臟中殘留量最高，平均(13540.9±581.00)μg/kg；其次為肺臟組織，平均(8142.53±428.12)μg/kg；接著依次為肝臟、皮脂及肌肉，平均殘留量為(7634.75±545.15)、(1158.07±231.26)及(1047.98±109.92)μg/kg。隨時間的延長，加米霉素在各組織中的殘留含量下降，在7d時，下降速度尤為明顯，肌肉、皮脂、肝臟、腎臟、注射點(diǎn)及肺臟的殘留量分別為(16.13±3.25)、(34.25±5.45)、(200.43±24.92)、(346.9±44.65)、(2092.75±386.42)和(753.5±90.95)μg/kg。之后，豬各組織中加米霉素殘留量下降緩慢，基本在28時，各組織均未殘留加米霉素。并通過各組織中加米霉素殘留量變化確定在動物體內(nèi)的靶組織為腎臟。

2.3 休藥期計(jì)算

由表2和圖4可知。休藥期的計(jì)算采用WT 1.4軟件，確保有95%的可信限使99%的殘留低于最大殘留量(MRL)。注射加米霉素后，豬各組織肌肉、皮脂、肝臟、腎臟及注射位點(diǎn)的休藥期分別為9.68、24.35、11.62、17.37及26.75d。

表1 注射加米霉素對豬不同組織殘留量實(shí)測數(shù)據(jù)(μg/kg)Tab.1 Measured data of injecting gamithromycin on different tissue residues in swine (μg/kg)

表2 注射加米霉素后豬的休藥期Tab.2 Swine withdrawal after injection of gamithromycin

3 討論

據(jù)歐洲藥物評價委員會(EMEA)研究報(bào)道[5]，給試驗(yàn)豬單劑量肌注射加米霉素6mg/kg B.W.；在給藥后第1、2、3、5、7、10及15天時，采集肌肉、肝臟、腎臟、脂肪及注射位點(diǎn)肌肉；其研究結(jié)果表明，在給藥后7、10和15d，腎臟中加米霉素原藥濃度分別為0.57、0.14和0.04μg/g，肝臟的分別為0.275、0.05和＜0.010μg/g，肌肉組織的分別為0.06、0.03和0.02μg/g，注射部位分別為0.98、0.52和0.23μg/g，脂肪組織中也呈現(xiàn)相似的消除代謝表型。本試驗(yàn)研究表明，豬注射加米霉素后，在0.5d時，各組織中加米霉素殘留量達(dá)到最高；隨之在一周后，含量迅速銳減下降。本試驗(yàn)與國外同類產(chǎn)品的殘留消除結(jié)果基本一致。同時本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加米霉素在豬各食性組織中殘留量按高低排列依次為，注射部位肌肉＞腎臟＞肺臟＞肝臟＞皮脂＞肌肉；本試驗(yàn)中各組織加米霉素殘留量高低同樣也與EMEA[5]報(bào)導(dǎo)結(jié)果相一致。

圖4 加米霉素注射液的組織殘留消除擬合圖Fig.4 Elimination of tissue residues in the injection of gamithromycin

根據(jù)參考?xì)W盟EMEA制定的豬MRL標(biāo)準(zhǔn)[1]，其肌肉、皮脂、肝臟及腎臟的最大殘留限量分別為100、100、100和300μg/kg。鑒于我國尚未制定加米霉素在豬組織中的最大殘留量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)。因此，綜合WT 1.4休藥期軟件處理結(jié)果，建議國產(chǎn)加米霉素注射液按推薦給藥方案，豬的休藥期定為27d。但據(jù)歐盟獸藥委員會(CVMP)公布加米霉素在豬上使用的休藥期為16d[5]。本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果與其不一致，可能原因?yàn)閯游镄菟幤诘拈L短不僅與產(chǎn)品加米霉素密切相關(guān)，還與執(zhí)行的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。由于各國制定的，動物使用加米霉素(含相同活性成分)殘留限量標(biāo)準(zhǔn)有可能不同。因此，即使相同活性成分的加米霉素在不同國家的休藥期也存在差異。

4 結(jié)論

豬單劑量肌注射國產(chǎn)加米霉素注射液(6mg/kg B.W.)，除注射部位肌肉外，腎臟殘留量最高，其次是肺臟、肝臟、皮脂及肌肉。建議豬的休藥期為27d。