微生物來(lái)源抗腫瘤先導(dǎo)化合物的靶向篩選研究

田敏 陳嘉 張鵬 俞巖青 王昆蓉 曹艷茹 雷葉明 鐘艾玲 朱輝

(1 成都大學(xué)，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052；2 成都雅途生物技術(shù)有限公司，微生物藥物生物合成技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，成都 610041)

惡性腫瘤是危害人類生命健康和社會(huì)發(fā)展的重大疾病，在我國(guó)，隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化和人口老齡化進(jìn)程的加快，加之不良生活習(xí)慣以及環(huán)境污染等問(wèn)題的存在，癌癥發(fā)病率和死亡率日益增加[1]。盡管不斷有新的抗癌藥物應(yīng)用于臨床，但在臨床治療過(guò)程中，抗腫瘤藥物仍面臨毒性大、治療適用范圍窄、易產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，需要持續(xù)不斷地研究、開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物。因此，世界主要國(guó)家均將抗腫瘤藥物列為國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃品種，預(yù)防、控制和治療癌癥已成為全球最重要的公共醫(yī)療問(wèn)題之一。

研究表明由Vezina等[2]1975年發(fā)現(xiàn)的雷帕霉素對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，能有效抑制腎移植患者的皮膚卡波西肉瘤，其結(jié)構(gòu)修飾衍生物依維莫司(everolimus)近年來(lái)先后被美國(guó)和歐洲批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌、伴有與結(jié)節(jié)狀腦硬化(TSC)相關(guān)的室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤(SEGA)、惡性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNET)、HR陽(yáng)性HER2陰性乳腺癌、腎血管平滑肌脂肪瘤，以及年幼兒童罕見(jiàn)腦腫瘤的治療[3]。其母核(雷帕霉素)結(jié)構(gòu)引起各國(guó)藥物研究者的重視，具有廣泛、深度的開(kāi)發(fā)前景。

本研究以具有抗腫瘤活性的化合物雷帕霉素胞內(nèi)結(jié)合蛋白R(shí)BP為靶標(biāo)，該RBP蛋白具有PPIase活性，可催化肽酰脯氨酰胺鍵的順-反式異構(gòu)轉(zhuǎn)化，使肽鏈折疊。將RBP的編碼基因克隆到啤酒酵母菌中，并將其構(gòu)建為氨基酸營(yíng)養(yǎng)依賴型重組微生物，應(yīng)用所構(gòu)建的基因重組工程菌作為模型篩選菌株，通過(guò)微生物的存活，快速、便捷的篩選特異性的雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物。本文主要報(bào)道從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中經(jīng)篩選獲得的活性化合物產(chǎn)生菌的初步鑒定、活性化合物的分離純化及結(jié)構(gòu)研究。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑

儀器：PCR儀(Thermal Cycler)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，GNP-9160型)；潔凈工作臺(tái)(蘇州凈化，SW-CJ-2FD型)；發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TD-L40B)；高效液相色譜儀(Aglient, 1200 Series)；DAC層析柱(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司，50mm)；真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DZF-6020型)；紫外掃描儀(島津UV-2450)；紅外儀(島津IRAfinity-1s)；高分辨質(zhì)譜(MicroTOF QII)；核磁共振波譜儀(Bruker Advance 600型)。

試劑：PCR擴(kuò)增酶及擴(kuò)增引物(上海生工生物工程有限公司)；硅膠(青島美高集團(tuán)有限公司，150～250目)；C18硅膠(Kromasil, 10μm)；乙酸乙酯、丙酮、正己烷、乙腈、甲酸和甲酸銨等分析純?cè)噭?成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

篩選模型用重組微生物工程菌RS及RS-N由本試驗(yàn)室保藏；活性化合物產(chǎn)生菌CY-365分離自四川阿壩地區(qū)土壤，保藏于四川抗菌素工業(yè)研究所菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖4，酵母粉4，麥芽抽提物10，CaCO32，瓊脂25，pH7.0。種子培養(yǎng)基(g/L)：甘油10，可溶性淀粉10，葡萄糖5，黃豆粉20，CaCO32，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油10，可溶性淀粉10，葡萄糖5，黃豆粉40，NaCl 2，賴氨酸5，MgSO4·7H2O 2，CaCO32，pH7.0。重組微生物工程菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉10，蛋白胨15，瓊脂20，pH6.5。

2 試驗(yàn)方法

2.1 模型篩選

采用攜帶雷帕霉素細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白R(shí)BP外源靶位基因的2株?duì)I養(yǎng)依賴型重組酵母工程菌篩選系統(tǒng)，對(duì)微生物來(lái)源的化合物樣品進(jìn)行篩選，根據(jù)兩株基因工程菌對(duì)所試樣品的敏感性和耐受性情況(表1)， 特異性地尋找雷帕霉素及其結(jié)構(gòu)類似物。

2.2 菌株分子鑒定

取CY-365菌體適量，加入5% Chelex 100 100μL，100℃水浴10min，12000r/min離心3min，留取上清液進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增[4]，上游引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)，下游引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系包括DNA模板2μL，上游引物27F(10μm)5μL，下游引物1492R(10μm)5μL，Buffer(10×)5μL，Taq酶0.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1.5μL，ddH2O 31μL；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)GoldView染色，瓊脂糖凝膠電泳、回收，送成都擎科生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI的BLAST進(jìn)行多序列相似性比對(duì)分析，利用MEGA7.0計(jì)算序列間的相似性并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[5]。

2.3 菌株CY-365的培養(yǎng)

無(wú)菌條件下刮取適量CY-365菌株的孢子，涂布接種于斜面培養(yǎng)基上，于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d后，將生長(zhǎng)成熟的斜面培養(yǎng)物，挖塊接種于500mL種子培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基裝量150mL，于28℃，220r/min 條件下培養(yǎng)3d，培養(yǎng)物按10%接種量接種于10L發(fā)酵罐，28℃，500r/min，空氣1:1(vvm)條件下培養(yǎng)6d，收集發(fā)酵液。

2.4 活性產(chǎn)物的分離提取

表1 篩選模型Tab.1 Screening model

CY-365深層發(fā)酵培養(yǎng)物10L，經(jīng)離心進(jìn)行固液分離，棄上清液，菌絲體用3倍體積乙酸乙酯抽提[6]，抽提液減壓濃縮后上樣于正相硅膠柱層析，分別用15%、20%和25%丙酮/正己烷梯度洗脫，TLC、HPLC檢測(cè)跟蹤洗脫進(jìn)程，分步收集，合并目標(biāo)組分純度大于70%的洗脫液，40～50℃、P≤-0.08MPa減壓濃縮至干，用乙腈溶解后經(jīng)降溫結(jié)晶 ，過(guò)濾，真空干燥得粗品2.8g。

將粗品加入200mL乙腈溶解完全，加水至500mL，經(jīng)DAC反相C18層析，55%乙腈洗脫，HPLC檢測(cè)，合并純度大于95%的洗脫液，減壓濃縮，濃縮液加乙酸乙酯萃取，分離萃取液濃縮至干，加乙腈溶解，降溫結(jié)晶，過(guò)濾，真空干燥制得CY-365純品918mg。

2.5 理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定

將經(jīng)分離純化得到的化合物CY-365進(jìn)行理化分析以及IR、UV、MS、NMR波譜檢測(cè)，并對(duì)各波譜信息進(jìn)行波譜解析。

2.6 HPLC分析條件

色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm, 5μm)；流動(dòng)相A：水(1000mL含0.63g甲酸銨，1mL甲酸)；流動(dòng)相B：乙腈；A:B=70:30；流速：1.0mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm；柱溫：50℃。

3 結(jié)果

采用攜帶雷帕霉素細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白R(shí)BP外源靶位基因的重組酵母工程菌篩選系統(tǒng)，經(jīng)對(duì)4000余個(gè)微生物來(lái)源樣品進(jìn)行篩選，獲得一個(gè)陽(yáng)性菌株CY-365。

3.1 菌種分類鑒定

菌株CY-365的16S rRNA基因序列經(jīng)過(guò)擴(kuò)增并測(cè)序，16S rDNA序列經(jīng)過(guò)NCBI的BLAST比對(duì)，利用軟件MAGE7.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。菌株CY-365與Streptomycessp.MM9(KU714924.1)的同源性達(dá)99%。

3.2 活性化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物CY-365為白色不定性粉末，可溶于丙酮、乙腈、乙醇，在乙醚中微溶，在水中幾乎不溶。化合物紫外吸收在277.4nm處有高強(qiáng)K吸收帶，表明分子中有3個(gè)共軛體系存在?；衔锛t外光譜在波數(shù)3417.86cm-1有中等強(qiáng)度吸收，說(shuō)明分子中含有羥基(OH)；在波數(shù)2968.45、2931.80和2873.94cm-1有吸收，說(shuō)明分子中含有飽和烴(CH3、CH2)；在波數(shù)1718.58cm-1有最強(qiáng)吸收，說(shuō)明分子中含有羰基(C=O)；在波數(shù)1645.28和1633.71cm-1有吸收，說(shuō)明分子中含有雙鍵(C=C)；在波數(shù)1450.47和1377.17cm-1有吸收，說(shuō)明分子中有CH3和CH2。

化合物CY-365的ESI-MS顯示分子離子峰m/z950.5622[M+Na]+，高分辨數(shù)據(jù)表明化合物分子式為C52H81NO13。

化合物CY-365的1H NMR、13C NMR(DEPT)及HSQC的相關(guān)性顯示：化合物含有52個(gè)碳的信號(hào)，包括10個(gè)甲基(CH3)，14個(gè)亞甲基(CH2)，20個(gè)次甲基(CH)和8個(gè)季碳(C)；其中化合物含有5個(gè)羰基碳(C=O)、2個(gè)甲氧基(CH3O)。由1H-1H COSY可知，CH-2、CH2-3、CH2-4、CH2-5、CH2-6存在依次相關(guān)信號(hào)，根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，CH-2、CH2-3、CH2-4、 CH2-5、CH2-6應(yīng)依次連接成雜環(huán)，同時(shí)次甲基碳CH-2與羰基碳C-1連接。由1H-1H COSY可知，CH-10、 CH2-11、CH2-12、CH-13、CH2-14、CH-15存在依次相關(guān)信號(hào)，甲基碳CH3-10a與次甲基碳CH-10相連，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，CH-10、CH2-11、CH2-12、CH-13、CH2-14、CH-15依次連接，季碳C-9與次甲基碳CH-10相連，次甲基CH-15與亞甲氧基CH2O-15a相連。由1H-1H COSY可知，CH2-15a和CH3-15b相關(guān)，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)可知，次甲基CH-15與乙氧基相連。由1H-1H COSY可知，CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21、CH2-23和CH-24存在依次相關(guān)信號(hào)，甲基碳CH3-22a與CH-22連接，甲基碳CH3-24a與CH-24連接，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21、CH2-23和CH-24依次連接，季碳C-16與CH-15、CH-17和CH3-16a連接，羰基碳C-25與CH-24和CH-26連接?；衔顲Y-365的CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21氫譜化學(xué)位移顯示，CH-17、CH-18、CH-19、CH-20、CH-21為依次相連的共軛烯烴。由1H-1H COSY可知，CH-26、CH-27相關(guān)，且氫譜化學(xué)位移顯示為與氧相連，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，次甲基CH-26與甲氧基CH3O-26a相連。由1H-1H COSY可知，CH-29、CH-30、CH3-30a依次相關(guān)，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，CH-29、CH-30、CH3-30a依次相連，季碳C-28與CH-29和CH3-28a相連，羰基碳C-31與CH-30和CH2-32相連。由1H-1H COSY可知，CH2-32、CH-34、CH2-35、CH-36依次相關(guān)，甲基碳CH3-34a與CH-34相連，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，CH2-32、CH-34、CH2-35、CH-36依次相連。由1H-1H COSY可知，CH-36、CH2-37、CH2-38、CH-39、CH-40、CH2-41、CH-36依次相關(guān)，再根據(jù)HMBC相關(guān)信號(hào)，CH-36、CH2-37、CH2-38、CH-39、CH-40、CH2-41、CH-36依次連接成六員環(huán)，次甲基CH-40與甲氧基CH3O-40a相連?；衔顲Y-365的1H NMR、13C NMR(DEPT)、HSQC、1H-1H COSY、HMBC數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖1 菌株CY-365與相關(guān)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Neighbour-Joining phylogenetic tree of CY-365 and relative strains

表2 化合物CY-365的1H NMR、13C NMR(DEPT)、HSQC、1H-1H COSY、HMBC數(shù)據(jù)(溶劑為CDCl3)Tab.2 1H NMR, 13C NMR(DEPT), HSQC, 1H-1H COSY and HMBC data for compound CY-365 in CDCl3

續(xù)表2

綜合UV、IR、ESI-MS和核磁分析，化合物CY-365含有羰基和共軛烯烴等基團(tuán)，含有52個(gè)碳(10個(gè)甲基、14個(gè)亞甲基、20個(gè)次甲基、8個(gè)季碳)，含有81個(gè)氫(3個(gè)羥基活潑氫)，分子式為C52H81NO13，鑒定為15-O-乙基雷帕霉素。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，通過(guò)雷帕霉素合成15-O-乙基雷帕霉素，其存在順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，對(duì)比參考文獻(xiàn)中兩種構(gòu)型的核磁數(shù)據(jù)，化合物CY-365為15(S)-O-乙基雷帕霉素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

4 討論

圖2 化合物CY-365的結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structure of compound CY-365

微生物由于其具有代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的特點(diǎn)，一直是新藥研究的重要源泉。本研究通過(guò)以雷帕霉素細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白R(shí)BP為靶位的特異篩選模型，從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中篩選并分離得到化合物CY-365，其產(chǎn)生菌經(jīng)菌種鑒定為放線菌鏈霉菌屬，化合物CY-365經(jīng)結(jié)構(gòu)解析研究表明為雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物乙氧基雷帕霉素，體外試驗(yàn)顯示與雷帕霉素對(duì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白R(shí)BP具有相同的結(jié)合活力。資料顯示，美國(guó)家用化學(xué)品公司通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)吸水鏈霉菌NRRL5491曾獲得雷帕霉素類似物脯氨酸雷帕霉素[8]；福建微生物研究所報(bào)道采用巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素，獲得26,40-O-雙去甲基雷帕霉[9]，從雷帕霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌發(fā)酵液中分離微量組分，獲得15-O-去甲雷帕霉素、15-O-乙基雷帕霉素、脯氨酸雷帕霉素、27-異帕雷帕霉素、26-O-去甲雷帕霉素[10]。 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院在構(gòu)建放線菌NP2-109生物合成雷帕霉素時(shí)，采用定點(diǎn)突變的方式獲得34, 35-雙鍵-26-O-去甲雷帕霉素[11]。本研究發(fā)現(xiàn)的乙氧基雷帕霉素經(jīng)立體構(gòu)型分析確定為15(S)-O-乙基雷帕霉素，由鏈霉菌直接代謝產(chǎn)生，且為鏈霉菌CY365的主要代謝產(chǎn)物，為乙氧基雷帕霉素的制備奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)乙氧基雷帕霉素進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾及構(gòu)效關(guān)系的深入研究，極有可能為抗癌藥物的源頭創(chuàng)新提供新的母核物質(zhì)。