阿托伐他汀通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)乙醇作用下AC16心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)合成代謝

李寧，張航，于波

（ 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

酒精性心肌病是長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的非缺血性擴(kuò)張型心肌病，臨床表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大、心功能不全和心律失常等［1］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，酒精性心肌病的發(fā)病機(jī)制涉及多層次、多水平的機(jī)制，如乙醇代謝途徑的酶代謝及營(yíng)養(yǎng)失衡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞壞死與凋亡以及鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。近年來(lái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 （endoplasmic reticulum stress，ERS） 在酒精性心肌病發(fā)病過(guò)程中的作用受到越來(lái)越多的重視。國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)ERS的研究目前多集中在肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺及部分腫瘤疾?。?-5］，較少針對(duì)心肌細(xì)胞，對(duì)酒精性心肌病細(xì)胞模型的相關(guān)研究更是少之又少。本研究在既往理論研究及實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，探討阿托伐他汀通過(guò)ERS對(duì)乙醇作用下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)合成代謝的影響機(jī)制，為將來(lái)的臨床研究提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 AC16心肌細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)與分組

取出液氮保存的AC16細(xì)胞 （購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司），立即37 ℃水浴快速解凍，中間過(guò)程輕搖冷凍管混勻，加速融化，完全融化后立刻離心。1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液。加入1 mL高糖DMEM完全培養(yǎng)基 （含10%胎牛血清，1%雙抗，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司） 重懸細(xì)胞沉淀，輕柔吹打均勻 （單細(xì)胞懸液） 后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10 cm培養(yǎng)皿中，并調(diào)整細(xì)胞密度約為20%～25%，該密度范圍讓復(fù)蘇細(xì)胞有足夠的培養(yǎng)時(shí)間以調(diào)整到最佳狀態(tài)。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （37 ℃，5% CO2），間隔12 h后換液，棄去原有培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入10 mL新鮮的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。之后2 d換液1次，每次吸棄原有培養(yǎng)基，更換10 mL新鮮的高糖DMEM完全培養(yǎng)基。待復(fù)蘇細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度，0.25%胰酶消化，至細(xì)胞變圓后吸棄胰酶，加入2～3 mL完全培養(yǎng)基脫離細(xì)胞并吹打至單細(xì)胞，按照1∶3比例傳代。傳代細(xì)胞貼壁12 h后換液，之后2 d 換液1次，2～3 d傳代1次。按照實(shí)驗(yàn)條件添加不同濃度乙醇及阿托伐他汀至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：正常組，未做任何處理，正常培養(yǎng)細(xì)胞；乙醇組，200 mmol/L乙醇處理AC16心肌細(xì)胞48 h；1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組，細(xì)胞處理基于乙醇組，分別使用1、10、100 μmol/L阿托伐他汀處理AC16心肌細(xì)胞48 h。

1.2 Western blotting

提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法 （試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司） 測(cè)蛋白濃度。根據(jù)蛋白分子量選擇所需要的SDS-PAGE凝膠濃度，SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后，加入用封閉液稀釋的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （glucose-regulated protein 78，GRP78） 、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白-1c （sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c） 和β-actin一抗，室溫?fù)u床孵育2 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min。再加入用封閉液稀釋的相應(yīng)二抗室溫?fù)u床孵育1 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min。ECL顯色檢測(cè)。蛋白的相對(duì)表達(dá)量用待測(cè)蛋白與β-actin的灰度值比值計(jì)算。

1.3 電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

收集細(xì)胞后，倒入2.5%戊二醛固定液，反應(yīng)4 h。0.1 mol/L PBS清洗3次，30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水各1次，每次20 min。100%乙醇脫水2次，每次20 min，乙酸異戊酯置換2次，每次20 min。將細(xì)胞均勻涂布蓋玻片上，-70 ℃冷凍12 h，冷凍干燥48 h，將蓋玻片樣品噴金粉后上樣，觀察。

1.4 甘油三酯 （triglyceride，TG） 含量測(cè)定

收集細(xì)胞后，采用TG檢測(cè)試劑盒 （GPO-PAP單試劑微板法，購(gòu)自北京欣華綠源科技有限公司） 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乙醇作用下心肌細(xì)胞ERS模型的建立

乙醇 （200 mmol/L） 處理AC16心肌細(xì)胞0、12、24、48 h后，Western blotting檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)GRP78蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶GRP78蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高 （圖1）。針對(duì)Western blotting條帶進(jìn)行灰度值定量分析，GRP78在0 h相對(duì)表達(dá)值為0.19±0.02，在12、24、48 h相對(duì)表達(dá)值分別為0.27±0.03、0.39±0.01、0.64±0.02。結(jié)果顯示，處理12、24、48 h后與0 h比較，GRP78蛋白表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P ＜ 0.05）。表明乙醇作用下AC16心肌細(xì)胞ERS模型建立成功，且ERS效應(yīng)具有時(shí)間依賴性。選取乙醇 （200 mmol/L） 處理AC16心肌細(xì)胞48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)對(duì)乙醇作用下心肌細(xì)胞ERS狀態(tài)的影響

圖1 Western blotting檢測(cè)200 mmol/L乙醇處理AC16心肌細(xì)胞0、12、24、48 h后GRP78蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of GRP78 protein in myocardial AC16 cells treated with 200 mmol/L ethanol for 0，12，24，and 48 hours visualized using Western blotting

Western blotting檢測(cè)正常組、乙醇組以及1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組的GRP78蛋白的相對(duì)表達(dá)量，來(lái)衡量ERS狀態(tài)。結(jié)果顯示，與乙醇組比較，1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組GRP78蛋白的表達(dá)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P ＜ 0.05），見圖2、表1。表明阿托伐他汀可以有效緩解乙醇作用下心肌細(xì)胞ERS反應(yīng)。

圖2 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)下心肌細(xì)胞GRP78蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of GRP78 protein in myocardial cells treated with different concentrations of atorvastatin

2.3 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)對(duì)乙醇作用下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察結(jié)果顯示，乙醇組AC16細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少、線粒體增大、線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂，時(shí)有線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失呈空泡樣改變。隨著阿托伐他汀干預(yù)濃度增加，AC16細(xì)胞形態(tài)及線粒體結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，其中100 μmol/L阿托伐他汀組可見大量線粒體，呈橢圓形，線粒體嵴結(jié)構(gòu)整齊，同正常組 （圖3）。表明阿托伐他汀干預(yù)可以緩解乙醇作用下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常改變。

2.4 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)對(duì)乙醇作用下心肌細(xì)胞脂質(zhì)合成代謝的影響

檢測(cè)各組脂質(zhì)合成代謝關(guān)鍵蛋白SREBP-1c及TG含量，結(jié)果顯示，與乙醇組相比，1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組SREBP-1c和TG含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P ＜ 0.05），見圖4、表1。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不只是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和折疊、脂質(zhì)合成以及細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的亞細(xì)胞器，還是調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激與調(diào)亡的亞細(xì)胞器，因而對(duì)維持心肌細(xì)胞功能、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。ERS是指多種因素導(dǎo)致的使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器病理狀態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外研究者一致以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶GRP78蛋白作為ERS反應(yīng)激活的標(biāo)志［6］。早期文獻(xiàn)［7-8］報(bào)道ERS參與如糖尿病心肌病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、缺血再灌注損傷等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，是心血管疾病的重要發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，不斷有研究［9］證明ERS在長(zhǎng)期乙醇攝入所致的心肌損傷中也發(fā)揮著重要作用。

表1 各組中GRP78蛋白、SREBP-1c和TG相對(duì)含量Tab.1 Relative levels of GRP78 protein，SREBP-1c，and triglycerides in different groups

圖3 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)對(duì)乙醇作用下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 ×500Fig.3 Effects of different concentrations of atorvastatin on ultrastructure of myocardial cells administered with alcohol ×500

圖4 不同濃度阿托伐他汀干預(yù)后心肌細(xì)胞SREBP-1c蛋白的相對(duì) 表達(dá)量Fig.4 Relative expression of SREBP-1c protein in myocardial cells upon treatment with different concentrations of atorvastatin

他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成早期限速酶的活性，繼而上調(diào)細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體，加速血漿低密度脂蛋白分解代謝的作用。近20年來(lái)，臨床研究［10-11］顯示他汀類藥物是當(dāng)前防治高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的重要的藥物。自從20世紀(jì)80年代以來(lái)，許多具有里程碑意義的研究證明了他汀類藥物在降低血脂方面的積極作用，表明其在心血管方面的許多作用獨(dú)立于其降低低密度脂蛋白的作用。各類文獻(xiàn)頻繁以“多效性”來(lái)概括其作用，其“多效性”作用包括抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、穩(wěn)定斑塊、改善內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)免疫、動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞、抗心律失常及預(yù)防碎死等作用。最新文獻(xiàn)［12］報(bào)道，他汀類藥物在ERS過(guò)程中具有確切的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的多種機(jī)制之一，但具體機(jī)制尚不清楚。

基于以上研究進(jìn)展及前期研究結(jié)果，為了進(jìn)一步研究阿托伐他汀通過(guò)ERS對(duì)酒精性心肌病的影響，本研究首先構(gòu)建了AC16心肌細(xì)胞ERS模型，在用200 mmol/L乙醇處理AC16心肌細(xì)胞后檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)，處理心肌細(xì)胞12、24、48 h后GRP78含量均較0 h顯著增加，表明AC16心肌細(xì)胞ERS模型建立成功。并且隨著處理時(shí)間的增加，GRP78表達(dá)量也隨之升高，推測(cè)在一定作用周期范圍內(nèi)，ERS效應(yīng)具有時(shí)間依賴性。隨后，本研究采用不同劑量 （1、10、100 μmol/L） 阿托伐他汀處理乙醇作用下心肌細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)隨著阿托伐他汀劑量的增加，可以不同程度的降低GRP78蛋白表達(dá)水平，100 μmol/L時(shí)降低的最多，表明阿托伐他汀可以有效緩解乙醇作用下心肌細(xì)胞ERS反應(yīng)。有關(guān)阿托伐他汀與ERS反應(yīng)的研究，過(guò)去大多集中在缺血再灌注發(fā)生機(jī)制上，如XIA等［13］證實(shí)了阿托伐他汀處理具有改善心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡有關(guān)；劉忠仁［14］通過(guò)觀察阿托伐他汀對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后GRP78和GADD153蛋白表達(dá)的影響，證實(shí)ERS途徑可能是阿托伐他汀對(duì)心肌再灌注后損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。這些結(jié)論與上述結(jié)果一致，也為探究酒精性心肌病中阿托伐他汀與ERS的關(guān)系提供了借鑒。

大量研究表明線粒體功能障礙是多種疾病的病理基礎(chǔ)，心肌作為高能量代謝組織，對(duì)線粒體功能改變更為敏感。MARN-GARCA等［15］證實(shí)心血管疾病、缺血性心肌病等均存在線粒體功能障礙，TERAGAKI等［16］在酒精性心肌病患者及動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常。本研究對(duì)不同處理組AC16細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果顯示乙醇組AC16細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少、線粒體增大、線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂，時(shí)有線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失呈空泡樣改變。隨著阿托伐他汀干預(yù)濃度增加，AC16細(xì)胞形態(tài)及線粒體結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，其中100 μmol/L阿托伐他汀組可見大量線粒體，呈橢圓形，線粒體嵴結(jié)構(gòu)整齊，同正常組，表明阿托伐他汀干預(yù)可以緩解乙醇作用下心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常改變，推測(cè)乙醇對(duì)酒精性心肌病發(fā)病的影響可能與其對(duì)線粒體生成的影響相關(guān)。

SREBP-1c是屬于“堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈”鋅指結(jié)構(gòu)域家族的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控TG代謝，其他的亞型分子包括SREBP-1a和SREBP-2，主要調(diào)節(jié)膽固醇代謝。FANG等［17］研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡不只影響蛋白質(zhì)的合成，還引起脂肪酸和膽固醇的代謝紊亂，在這個(gè)過(guò)程中SREBP-1c是重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一。通過(guò)檢測(cè)脂質(zhì)合成代謝關(guān)鍵蛋白SREBP-1c和TG含量，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴，從而探究阿托伐他汀對(duì)心肌細(xì)胞脂質(zhì)合成代謝的影響。本研究檢測(cè)了SREBP-1c及TG含量，結(jié)果表明乙醇引發(fā)的ERS會(huì)顯著提高SREBP-1c及TG含量，而阿托伐他汀干預(yù)則可以緩解其異常表達(dá)。但是有關(guān)阿托伐他汀如何通過(guò)激活SREBP-1c促進(jìn)脂質(zhì)合成代謝，其機(jī)制仍不明確。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了ERS與脂質(zhì)沉積的直接關(guān)系，并且證明阿托伐他汀可抑制乙醇作用下ERS相關(guān)因子GRP78表達(dá)，改善酒精性心肌病細(xì)胞模型細(xì)胞體態(tài)、線粒體超微結(jié)構(gòu)及脂代謝情況。本研究在既往理論研究及實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步說(shuō)明阿托伐他汀通過(guò)ERS對(duì)乙醇作用下心肌細(xì)胞影響的變化規(guī)律，為將來(lái)的臨床研究提供可靠的依據(jù)。