法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑誘導(dǎo)小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

郭賢利，郭姝彤，符兆英

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(Farnesyltransferase inhibitor)可作用于Ras-ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，在國外已被廣泛用于惡性腫瘤分子靶向治療的研究，有的制劑已經(jīng)進(jìn)入了臨床I期或II期研究，但在國內(nèi)對(duì)法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究和報(bào)道尚不多[1-6]。我們將法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777用于誘導(dǎo)小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞系Beta-TC-6細(xì)胞的凋亡，以探討其作為抗腫瘤藥物的理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自Cibco公司，用前添加4 Mm/L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖及1.5 g/L碳酸氫鈉。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，用前在水浴箱中56 ℃，30 min滅活。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777、二甲苯噻唑-2，5聯(lián)苯四唑溴(MTT)、二甲基亞砜、碘化丙啶購自Sigma公司。Beta-TC-6小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將BETA-TC-6細(xì)胞在含胎牛血清15%、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 g/mL的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2和飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，用于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞做加藥后細(xì)胞增殖抑制與凋亡誘導(dǎo)的研究。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

將處于對(duì)數(shù)生長期的BETA-TC-6細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液制成3×105細(xì)胞/mL的懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，留幾個(gè)邊緣孔不加細(xì)胞，只加細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，5%CO2，37 ℃，飽和濕度培養(yǎng)。至細(xì)胞單層鋪滿孔底80%左右，加入梯度濃度的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777 0.5 μmol/L、1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并留5個(gè)孔不加藥、只加細(xì)胞培養(yǎng)液做陰性對(duì)照，在37℃，5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。向各孔加入20 μL 5 mg/mLMTT溶液(0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去各孔內(nèi)含MTT培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫下輕搖30 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國Bio-Rad)在波長490 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD490)。用以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=(陰性對(duì)照孔平均OD值-試驗(yàn)孔平均OD值)/陰性對(duì)照孔平均OD值。

1.4 碘化丙啶染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)

對(duì)數(shù)生長期的BETA-TC-6細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105細(xì)胞/mL，接種于置有無菌蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5%CO2，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為1.5 μmol/L、2.5 μmol/L、3.5 μmol/L的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777，同時(shí)設(shè)不加試劑的對(duì)照孔，繼續(xù)5%CO2，37℃，飽和濕度培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞，以1000 r/min離心5 min，棄去上清液，用5 mL PBS洗一次，加入500 μL冰預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定1 h，離心棄除固定液，用5 mL PBS洗一次，用PBS 2 mL重懸細(xì)胞，加入20 μL碘化丙啶(濃度50 mg/L)，充分混勻，室溫避光染色30 min，加5 mL PBS，1000 r/min離心5 min，棄上清，洗2次后重懸細(xì)胞并滴片，用蓋玻片封片。用熒光顯微鏡(氬離子激發(fā)光源)觀察細(xì)胞核的染色和形態(tài)改變、染色質(zhì)凝聚等情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)樣品準(zhǔn)備：用六孔板培養(yǎng)BETA-TC-6細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔底約80%后，用R115777對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24 h處理，收集細(xì)胞約106個(gè)，1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用3 mL PBS洗一次。離心去除PBS，加預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定1 h。離心去除固定液，加3 mL PBS重懸細(xì)胞。400目尼龍網(wǎng)過濾1次，1000 r/min離心5 min，棄去上清。加1 mL PI染液，在4℃下避光染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：用氬離子作為激發(fā)光源，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長大于630 nm，為紅色熒光。分析DNA含量直方圖、亞G1期細(xì)胞所占百分比和細(xì)胞周期改變。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)顯示R115777對(duì)BETA-TC-6細(xì)胞增殖的影響

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，R115777對(duì)BETA-TC-6細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈劑量依賴性(見表1)；各個(gè)濃度的R115777作用24 h和作用48h的平均OD490值相比，沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.2 熒光顯微鏡下觀察R115777作用后BETA-TC-6細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

BETA-TC-6細(xì)胞經(jīng)R115777作用24 h后，用碘化丙啶染色，在熒光顯微鏡下，可觀察到細(xì)胞核和染色質(zhì)出現(xiàn)凋亡的形態(tài)改變。對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)較規(guī)整，核較大而圓整。經(jīng)R115777作用后，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核縮小、核染色質(zhì)凝聚和碎裂等改變(見圖1)。上述改變隨R115777作用濃度的增大而更加明顯。

表1 法尼基轉(zhuǎn)移酶R115777對(duì)BETA-TC-6細(xì)胞的增殖抑制作用

注：☆與對(duì)照組比P>0.05，*與對(duì)照組比P<0.05，a與0.5 μmol/L組比P<0.05，b與1.5 μmol/L組比P<0.05，c與組2.5 μmol/L比P<0.05。

圖1小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞Beta-TC-6用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777處理后碘化丙啶染色的熒光顯微鏡形態(tài)。左圖為未加藥的細(xì)胞，右圖為凋亡細(xì)胞。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)顯示R115777引起B(yǎng)ETA-TC-6細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞周期改變

用R115777處理24 h的BETA-TC-6細(xì)胞，用碘化丙啶染色后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組細(xì)胞在DNA直方圖上可見明顯的亞G1峰，處理組細(xì)胞凋亡率達(dá)79.8%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為5.6%。表明R115777明顯地誘導(dǎo)了BETA-TC-6細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，用R115777處理24h的BETA-TC-6細(xì)胞，有42%處于G2/M期，而對(duì)照組細(xì)胞僅有16%處于G2/M期，表明R115777處理后，BETA-TC-6細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯。

3 討論

胰島素瘤又稱胰島β-細(xì)胞瘤，是胰島細(xì)胞瘤中最常見的一種腫瘤，占胰島細(xì)胞腫瘤的70%～75%。胰島素瘤以反復(fù)發(fā)作的空腹時(shí)低血糖癥為特征，是器質(zhì)性低血糖癥較常見的原因。本病約83%為胰島β細(xì)胞良性腫瘤，約7%為β-細(xì)胞增生，惡性腫瘤不到10%。約91.4%的胰島素瘤為單發(fā)，瘤體一般較小，直徑在1～2.5 cm者占82%左右[7-8]。盡管瘤體積小，但其不受調(diào)控的胰島素大量分泌可引起嚴(yán)重的臨床后果。胰島素由胰島β-細(xì)胞經(jīng)“膜融合”和“kiss-and-run”兩種方式分泌[9]，在正常情況下，胰島素的分泌受血糖濃度的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)血糖濃度下降時(shí)，胰島素的分泌受到抑制，當(dāng)血糖降至1.94 mmol/L時(shí)，胰島素分泌幾乎完全停止。但在胰島素瘤，這種生理反饋機(jī)制完全喪失，瘤細(xì)胞持續(xù)地分泌胰島素，不受血糖濃度調(diào)節(jié)，因而導(dǎo)致低血糖的發(fā)生。人體腦細(xì)胞的代謝活動(dòng)只能依賴葡萄糖而不能利用糖原提供能量，故反復(fù)發(fā)作的低血糖可對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷。由于胰島素瘤體積一般較小，臨床上不易定位診斷，導(dǎo)致了手術(shù)切除的困難。因此，探索非手術(shù)治療的方法很有必要[10-12]。

近些年來，抗腫瘤藥物的研究正從細(xì)胞毒作用向分子靶向治療的方向發(fā)展，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑即是以腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為作用靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑通過抑制包括Ras蛋白在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的法尼基化修飾而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。

Ras蛋白是一類由Ras基因編碼、具有結(jié)合GTP功能的蛋白質(zhì)，有分子開關(guān)之稱，可在有活性的GTP結(jié)合型與無活性的GDP結(jié)合型兩種形式之間循環(huán)變換，是參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵性分子。Ras蛋白與GTP結(jié)合后，其GTP酶活性可將GTP水解成GDP而使后者失去作用，Ras基因突變后，其GTP酶活性降低，不能有效地將GTP水解成GDP而使其失活，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增生而發(fā)生腫瘤[2]。

研究表明，Ras蛋白只有在結(jié)合于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)之后，才具有生物學(xué)活性。但Ras蛋白本身由于疏水性差，不容易結(jié)合于脂質(zhì)的細(xì)胞膜，需要經(jīng)過加工修飾以后，才能定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。該加工修飾是在Ras蛋白翻譯后進(jìn)行的，是在法尼基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將膽固醇合成途徑中的中間體法尼基焦磷酸酯上的法尼基(一個(gè)15碳的類異戊二烯基團(tuán))，轉(zhuǎn)移到Ras蛋白的CAAX四肽結(jié)構(gòu)(C=半胱氨酸，A=脂肪族氨基酸，X=絲氨酸或甲硫氨酸)中半胱氨酸殘基的-SH功能基團(tuán)上。這一加工修飾稱為法尼基化修飾，對(duì)Ras蛋白的膜定位和生物學(xué)活性是必需的。法尼基轉(zhuǎn)移酶是催化該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，抑制其活性，即可阻斷Ras蛋白的法尼基化修飾，從而可以有效地抑制Ras蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，抑制Ras促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞生長[3]。

本實(shí)驗(yàn)用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777作用于小鼠胰島素瘤胰島β細(xì)胞Beta-TC-6，經(jīng)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率、碘化丙啶染色在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)改變和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞周期改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R115777處理能使BETA-TC-6細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡。因此，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑R115777有希望作為一種作用于腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子靶向治療的抗腫瘤藥物。