角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞和神經(jīng)纖維密度與干眼程度的相關(guān)性研究

程 鈺，吳 潔，朱海峰，程 燕，郝兆芹，陸慧琴，王亞妮

(西安市第一醫(yī)院眼科；陜西省眼科研究所；陜西省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；陜西省眼科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心；西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院，陜西 西安 710002)

干眼是眼科門診最常見(jiàn)的疾病之一。2017年國(guó)際淚膜和眼表協(xié)會(huì)(Dry Eye Work shop，DEWS)第二次會(huì)議發(fā)布了干眼新共識(shí)DEWⅡ。在DEWⅠ共識(shí)的基礎(chǔ)上，將干眼重新定義為以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征并伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病。其病理生理機(jī)制主要是淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表炎癥和損傷及神經(jīng)感覺(jué)異常[1]。角膜神經(jīng)主要由三叉神經(jīng)的終末支-睫狀神經(jīng)發(fā)出[2]。角膜神經(jīng)對(duì)保持眼表穩(wěn)態(tài)起到了重要的作用，為角膜提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)修復(fù)、調(diào)節(jié)感覺(jué)[3]。與眼表的炎癥和免疫相關(guān)的細(xì)胞有很多種，角膜樹(shù)突狀細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)與干眼的發(fā)病具有重要關(guān)系[4-7]。近來(lái)，角膜樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)的變化也受到了廣泛關(guān)注，樹(shù)突狀細(xì)胞體積的增大樹(shù)突的增加是其成熟、激活、MHC-II(HLA-DR)表達(dá)及抗原提呈能力的體現(xiàn)[8-9]。因此，對(duì)干眼患者角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞和神經(jīng)纖維的觀察有利于更好的了解干眼的病情。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年12月至2017年9月在西安市第一醫(yī)院門診就診，確診為干眼的患者共60例(輕度、中度、重度患者各20例，40眼)，其中男性25人，女性35人，年齡14～58歲，平均年齡41.5歲。排除干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，且患者均無(wú)眼部過(guò)敏史、過(guò)去3個(gè)月接觸鏡佩戴史或感染性角膜炎史、屈光手術(shù)史、眼內(nèi)手術(shù)史或糖尿病史。根據(jù)2013年干眼臨床診療專家共識(shí)，將所有患者按干眼程度分為輕度、中度和重度三組。輕度：輕度主觀癥狀，無(wú)角結(jié)膜熒光素染色；中度：中重度主觀癥狀，有角結(jié)膜熒光素染色，但經(jīng)過(guò)治療后體征可消失；重度：中重度主觀癥狀，角結(jié)膜熒光素染色明顯，治療后體征不能完全消失。所有患者均為雙眼發(fā)病，部分患者雙眼嚴(yán)重程度不同歸入不同組內(nèi)。

1.2 檢查方法

1.2.1 共聚焦顯微鏡 對(duì)所有患者雙眼行角膜共聚焦顯微鏡檢查。采用德國(guó)海德堡Retina Tomograph III Rostock Cornea Module(HRT Ⅲ RCM)激光共聚焦顯微鏡。HRT Ⅲ RCM使用波長(zhǎng)670 nm的激光光源，放大倍率為800倍，水平及縱向分辨率為1 μm，采集圖像尺寸400×400 μm，實(shí)際面積為0.16 mm2。于檢查前在結(jié)膜囊下穹隆部滴1滴10 g/L的鹽酸奧布卡因。檢查在矢狀軸進(jìn)行，對(duì)全部患者進(jìn)行角膜中央?yún)^(qū)圖像采集，每層至少5張圖片。全部患者未出現(xiàn)檢查并發(fā)癥。

1.2.2 圖像分析 對(duì)每一眼選取三張圖片進(jìn)行分析。圖片選取要求：位于角膜中央?yún)^(qū)，基底膜附近，深度約50～70 μm處，能清晰顯示樹(shù)突狀細(xì)胞及基底層下神經(jīng)纖維，且無(wú)褶皺，對(duì)比度良好。使用共聚焦顯微鏡軟件自帶的細(xì)胞計(jì)數(shù)工具對(duì)每一幅圖樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，得出樹(shù)突狀細(xì)胞密度，取平均值。使用ImageJ圖形分析軟件計(jì)算每幅圖中基底層下神經(jīng)纖維的總長(zhǎng)度，進(jìn)而計(jì)算出神經(jīng)纖維的密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。Spearman法對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞密度和神經(jīng)纖維密度與干眼程度進(jìn)行相關(guān)性分析；使用Kruskal-Wallis法對(duì)各組之間樹(shù)突狀細(xì)胞密度及神經(jīng)纖維密度進(jìn)行差異分析，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞及基底層下神經(jīng)纖維密度與干眼程度的相關(guān)性分析

Spearman法，α=0.05，雙尾，P<0.05相關(guān)有顯著性。角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞密度與干眼程度之間為正相關(guān)(r=0.293，P=0.001)；基底層下神經(jīng)纖維密度與干眼程度之間為負(fù)相關(guān)(r=-0.331，P<0.001)。隨著干眼程度加重，角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞密度增加，基底層下神經(jīng)纖維密度下降。

表1 角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞及神經(jīng)纖維密度與干眼程度相關(guān)性分析

注：相關(guān)性在0.01水平上顯著(雙尾)

2.2 輕度、中度及重度干眼組之間樹(shù)突狀細(xì)胞及神經(jīng)纖維密度的差異性分析

Kruskal-Wallis法，α=0.05，雙尾，P<0.05相關(guān)有顯著性。不同程度干眼患者角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞密度總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=11.502，

P=0.003)，兩兩比較，中度組、重度組高于輕度組，均有顯著性；基底層下神經(jīng)纖維密度總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=13.157，P=0.001)，兩兩比較，重度組低于輕度組，均有顯著性。

表2 輕度、中度及重度干眼角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞及基底下神經(jīng)纖維密度差異分析

注：*表示與輕度組比較，P<0.05

2.3 典型圖示

圖像尺寸400×400μm，放大倍率為800倍。圖A輕度干眼患者基底層下神經(jīng)纖維走形平滑，箭頭所示為樹(shù)突狀細(xì)胞，數(shù)量較少且胞體較??；圖B重度干眼患者基底層下神經(jīng)纖維密度下降、迂曲、分支增多，箭頭所示為樹(shù)突狀細(xì)胞，胞體較大、樹(shù)突增加且數(shù)量較多；圖C使用ImageJ軟件追蹤神經(jīng)纖維；圖D根據(jù)追蹤軌跡計(jì)算神經(jīng)纖維長(zhǎng)度；圖E共聚焦顯微鏡自帶細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3 討論

近年來(lái)，角膜共聚焦顯微鏡在角膜眼表疾病診治中得到了廣泛應(yīng)用，它可以在細(xì)胞水平觀察角膜，能夠?qū)崟r(shí)的觀察到角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞和神經(jīng)纖維的影像，并且已經(jīng)被證明和免疫組織化學(xué)的結(jié)果一致[10-11]。本次研究中我們對(duì)干眼患者角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞及神經(jīng)纖維密度進(jìn)行定量分析，可以更準(zhǔn)確的反應(yīng)干眼的程度和疾病的狀態(tài)。因?yàn)樗臒o(wú)創(chuàng)性，可以多次檢查，動(dòng)態(tài)觀察干眼的病情變化。

干眼眼表炎癥是基于免疫異常的非感染性炎癥[12]。固有免疫和適應(yīng)性免疫均參與干眼的病理生理過(guò)程。目前研究表明，干眼患者角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、樹(shù)突的數(shù)目均存在著較大的變化。角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞，是一種專業(yè)的抗原提呈細(xì)胞，在角膜免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。除免疫細(xì)胞外，趨化因子、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子在干眼免疫中也起到了重要的作用。白介素6可由活化的樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，干眼患者淚液中白介素6、白細(xì)胞介素17A和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β均顯著升高，且與眼表的各項(xiàng)參數(shù)具有相關(guān)性[13]。角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)和密度可以從一定程度上反映眼表的炎癥情況。神經(jīng)感覺(jué)異常是干眼發(fā)病的新機(jī)制之一，傳入神經(jīng)將眼表炎性因子刺激、滲透壓變化等信息傳遞到中樞，傳出神經(jīng)支配瞬目及眼表腺體的分泌[14]。炎癥可以使神經(jīng)敏感性增加[15]，炎癥和神經(jīng)損害是一組惡性循環(huán)，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。

此次研究中，我們得到的結(jié)論與上述研究結(jié)果基本符合。隨著干眼程度的加重角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞的密度增加，基底層下神經(jīng)纖維密度下降。從一定程度上說(shuō)明了炎癥程度和干眼程度的相關(guān)性，炎癥加重的同時(shí)神經(jīng)損害也加重。但此次收集的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，可能與樣本量較小、選擇偏差和未嚴(yán)格限制入組年齡區(qū)間有關(guān)。既往研究報(bào)道，角膜基底層下神經(jīng)纖維密度以每年0.9%的速度線性下降[16]，所以在后期研究中應(yīng)將年齡因素加入考察指標(biāo)中。在研究中，我們還發(fā)現(xiàn)干眼程度增加，樹(shù)突狀細(xì)胞不僅密度增加，活化的比率、胞體體積、樹(shù)突數(shù)目均增加；同時(shí)隨著干眼程度增加，基底層下神經(jīng)纖維不僅密度下降，而且走形迂曲分支增多。這些結(jié)果提示，炎癥可能導(dǎo)致角膜神經(jīng)支配減少，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在的相互作用[17]。

綜上所述，干眼患者角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞密度和基底層下神經(jīng)纖維的密度與干眼嚴(yán)重程度之間存在顯著相關(guān)性。角膜共聚焦顯微鏡能觀察角膜上皮樹(shù)突狀細(xì)胞和神經(jīng)纖維并定量分析，為干眼的診斷和嚴(yán)重程度評(píng)估提供依據(jù)。