馬克斯克魯維酵母外切菊粉酶INU1的晶體結(jié)構(gòu)研究

李 龍，蘇曉琴，方自安，周峻崗，胡小健，呂 紅

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2.上海工業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200438)

菊粉(Inulin)是一種主要由β-D-呋喃果糖殘基通過β(2→1)鍵連接的多糖聚合物，其末端通常為葡萄糖.它存在于多種植物中，特別是在根或根莖中含量豐富，在植物根的干粉中菊粉的凈含量甚至超過70%[1].由于來源豐富，菊粉作為原材料被廣泛應(yīng)用于高果糖漿的工業(yè)生產(chǎn)，它也可作為碳源生產(chǎn)乙醇等生物燃料以及作為動(dòng)物飼料添加劑[2-4].

菊粉酶(Inulinase)又稱為2，1-β-D-果聚糖果糖水解酶，可以將菊粉水解成果糖和低聚果糖，它廣泛存在于酵母菌、曲霉和一些其他微生物中.菊粉酶可作為工業(yè)酶應(yīng)用于食品工業(yè)中高果糖漿、低聚果糖和多聚果糖的生產(chǎn)[2，5-7]，也有一些報(bào)道將菊粉酶應(yīng)用于乙醇的生產(chǎn)[8-10].酵母菌具有繁殖周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)以及生物安全性高等特點(diǎn)，從而成一種工業(yè)化生產(chǎn)菊粉酶的良好來源[11-12].其中，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)由于耐熱性好、產(chǎn)生的菊粉酶活力高和表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)而得到了廣泛的使用[12-14].

按照菊粉酶的反應(yīng)類型，菊粉酶被分為外切菊粉酶(E.C.3.8.1.80)和內(nèi)切菊粉酶(E.C.3.2.1.7).其中外切菊粉酶水解菊粉末端的果糖單元，內(nèi)切菊粉酶則將菊粉斷裂為菊粉寡糖.前者能夠用于生產(chǎn)高果糖漿，后者用于生產(chǎn)不同聚合長(zhǎng)度的菊粉寡糖[13，15].在1991年，Laloux等人克隆和表達(dá)了來源于K.marxianusATCC12424菌株的第一個(gè)外切菊粉酶基因INU1[16].為了深入研究馬克斯克魯維酵母外切菊粉酶INU1的結(jié)構(gòu)和功能，我們?cè)谇捌谘芯縖15]的基礎(chǔ)上構(gòu)建了馬克斯克魯維酵母INU1的表達(dá)質(zhì)粒，并在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，之后通過陰離子交換層析獲得了純化的INU1菊粉酶，成功結(jié)晶后我們解析得到了分辨率為2.8?的INU1晶體結(jié)構(gòu).對(duì)該晶體結(jié)構(gòu)的解析和分析，將幫助我們確定催化反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸以及為后續(xù)的酶學(xué)改造提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

以含INU1基因(GenBank: X68479.1)的原始質(zhì)粒CB104為模板，通過PCR擴(kuò)增DNA并在基因的5’端和3’端分別引入SnaBⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物序列為5’-GACCTACGTAATGAAGTTCG-CATACTCCCTCTTGC-3’，下游引物序列為5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAACGTTAAATTGG-GTAACGTTAAAT-3’.PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行鑒定，然后通過DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)純化.純化后的PCR產(chǎn)物以及pPIC9畢赤酵母蛋白表達(dá)載體(Invitrogen公司)，兩者經(jīng)限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和NotⅠ(TaKaRa公司)雙酶切消化后進(jìn)行連接反應(yīng)，得到的重組質(zhì)粒pPIC9-INU1以核酸測(cè)序的方法驗(yàn)證.

1.2 外切菊粉酶INU1的表達(dá)、活性檢測(cè)與純化

測(cè)序成功的重組質(zhì)粒pPIC9-INU1使用SalⅠ線性化后，通過電穿孔的方式(Eppendorf，電穿孔儀2510)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168(his4，pep4)菌株(Invitrogen，131020sa)中.通過平板篩選后挑取單菌落，于5mL YPD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(200r/min、30℃)至OD600為2～6后，3000r/min、5min離心收集菌體.菌體重懸于50mL BMMOL/LY培養(yǎng)基，每24h加入終濃度為1%的無水甲醇誘導(dǎo)72h后，10000×g、15min收集培養(yǎng)上清液，收集的上清液在透析緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，pH 8.0)中透析4次，每次4h.

取0.5mL透析后的發(fā)酵上清液，與2.5mL 5%(質(zhì)量濃度)的菊粉混合，在0.05mol/L醋酸緩沖液pH4.7中50℃溫浴5min，反應(yīng)后釋放的果糖或葡萄糖使用DNS比色法進(jìn)行定量[17].酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U).

INU1可以使用陰離子交換柱進(jìn)行純化，首先使用平衡緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L NaCl，pH8.0)平衡HiTrap Q HP柱(GE公司)，然后將蛋白低速流過結(jié)合在Q柱上，最后用洗脫緩沖液A(50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH8.0)和洗脫緩沖液B(50mmol/L Tris-HCl，400mmol/L NaCl，pH8.0)梯度洗脫蛋白.以上各組分，以12%的SDS-PAGE膠鑒定蛋白表達(dá)和純化情況.

以截留分子量為30kDa的超濾管(Millipore公司)將純化后的蛋白洗脫液濃縮，并換液至20mmol/L Hepes pH7.2、200mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和5%甘油的緩沖液中進(jìn)行結(jié)晶篩選.

1.3 結(jié)晶與數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析

在20℃培養(yǎng)條件下，使用Crystal Screen、Crystal Screen 2和PEG/Ion Screen晶體篩選試劑盒(Hampton research公司)進(jìn)行結(jié)晶初篩，之后使用24孔板懸滴法對(duì)初篩得到的結(jié)晶條件進(jìn)行重復(fù)和優(yōu)化.INU1菊粉酶的晶體衍射數(shù)據(jù)于中國(guó)科學(xué)院上海同步輻射中心(SSRF)BL17U線站收集[18]，衍射數(shù)據(jù)經(jīng)HKL2000[18]進(jìn)行整合處理，之后使用分子置換方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)構(gòu)的解析優(yōu)化使用CCP4、Coot等軟件[19-20]，所有結(jié)構(gòu)示意圖通過Pymol軟件(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schr?dinger, LLC)制作.INU1的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)已上傳到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB序列號(hào)8J0T).

2 結(jié)果與分析

2.1 外切菊粉酶INU1的純化和結(jié)晶

通過畢赤酵母SMD1168(his4，pep4)分泌表達(dá)的INU1顯示出很高的酶活，在pH4.7的緩沖液中50℃條件下，INU1的酶活可以達(dá)到1671U/mL，比通過畢赤酵母GS115表達(dá)的外切菊粉酶活性要高得多[21-22].經(jīng)陰離子交換層析能獲得高純度的INU1蛋白，在SDS-PAGE膠上的蛋白條帶位置與INU1的理論分子量62kDa一致(圖1(a)，@@@484頁(yè)）.蛋白樣品濃縮至10mg/mL進(jìn)行結(jié)晶篩選，初篩時(shí)在18%PEG4000、0.1mol/L二甲胂酸鈉pH 6.0、0.2mol/L MgCl2條件下獲得了INU1晶體.通過24孔板懸滴法進(jìn)行重復(fù)優(yōu)化(1μL蛋白溶液和1μL沉淀劑溶液混合、1mL的池液)并在1周后獲得長(zhǎng)條狀三維蛋白晶體，其尺寸為5mm×0.3mm×0.3mm(圖1(b)，@@@484頁(yè)）.晶體浸泡在防凍液(20%PEG4000、0.1mol/L二甲胂酸鈉、0.1mol/L MgCl2和20%甘油，pH6.0)約30s后，速凍于液氮中.

圖1 菊粉酶INU1的純化和結(jié)晶Fig.1 Thepurification and crystallization of inulinase INU1(a)為純化的SDS-PAGE膠圖.其中M條帶為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，S為畢赤酵母分泌表達(dá)的上清，P為表達(dá)后的沉淀，L為HiTrap Q HP的上樣樣品，F(xiàn)為未結(jié)合Q柱的流穿液.(b)為優(yōu)化后的INU1晶體.

2.2 外切菊粉酶INU1的整體結(jié)構(gòu)

INU1晶體的衍射數(shù)據(jù)于中國(guó)科學(xué)院上海同步輻射光源(SSRF)BL17U線站收集，使用的X射線波長(zhǎng)為1.0082?，曝光時(shí)間為1s，溫度為100K，晶體旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)為0.5°，共收集旋轉(zhuǎn)100°的衍射圖譜數(shù)據(jù).

INU1晶體空間群為I4122，晶胞參數(shù)a=b=c=172.65?，Matthews系數(shù)為2.61?3/D，溶劑含量為52.82%.用于收集衍射數(shù)據(jù)的INU1晶體質(zhì)量較高，其鑲嵌度為0.62，分辨率達(dá)到了2.80?，收集的衍射數(shù)據(jù)有99.86%的完整性，Rmerge為9.8%(表1).

表1 INU1的晶體學(xué)參數(shù)表

*括號(hào)中為最高分辨率外殼層的值.

以氨基酸序列同一性為52%的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉(zhuǎn)化酶(PDB ID 4EQV)晶體結(jié)構(gòu)作為模板，使用分子置換法我們完成了INU1的晶體結(jié)構(gòu)解析.完成晶體結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的Rcrystal和Rfree值分別為0.20和0.27，平均B因子為50.12?2，拉氏圖(Ramachandran plot)分析顯示最后的結(jié)構(gòu)模型中99.9%的氨基酸的二面角都處于最優(yōu)或允許的區(qū)間.

晶體結(jié)構(gòu)顯示在每個(gè)不對(duì)稱單元中有兩個(gè)INU1蛋白分子面對(duì)面形成一個(gè)二聚體的堆積方式(圖2(b)).這兩條鏈的結(jié)構(gòu)基本一致，把兩條鏈根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合時(shí)顯示Cα原子的均方根偏差為0.356?.計(jì)算兩個(gè)分子的表面積為34400?2，相互作用界面包埋的相互作用面積為6585.6?2，標(biāo)準(zhǔn)的解離自由能約為17kcal/mol，提示晶體中顯示的這個(gè)二聚體在溶液中也是一個(gè)非常穩(wěn)定的聚合狀態(tài)，這與GH32家族中其他糖苷水解酶的二聚化一致.在這個(gè)晶體結(jié)構(gòu)中，還確定了20個(gè)結(jié)合的水分子，在每條鏈的Asn226還結(jié)合了兩個(gè)以β(1→4)糖苷鍵聯(lián)接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)分子(圖2(a)).

INU1共有555個(gè)氨基酸殘基，其中N端1～16號(hào)氨基酸為信號(hào)肽，17～23號(hào)氨基酸為前肽區(qū).在晶體結(jié)構(gòu)中，除了N端前面的32個(gè)氨基酸和第252位到262位的一個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)，其他氨基酸都能根據(jù)電子云密度清楚地確定位置.INU1的單體由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成: N端高度保守的β螺旋槳結(jié)構(gòu)域，由5個(gè)典型的β折疊葉片(Ⅰ～Ⅴ)組成，而C端較不保守的β夾層結(jié)構(gòu)域包括12個(gè)β折疊片層(圖2(c)).

INU1屬于糖苷水解酶32家族(Glycoside Hydrolase Family 32, GH32)(圖3).根據(jù)氨基酸序列相似性糖苷水解酶的可分為156個(gè)家族，GH32家族主要包括轉(zhuǎn)化酶(EC 3.2.1.26)、內(nèi)切菊粉酶(EC 3.2.1.7)、左旋糖苷酶(EC 3.2.1.65)和外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)等.該家族在結(jié)構(gòu)上的主要特點(diǎn)就是具有保守的5葉片β螺旋結(jié)構(gòu)域[23].INU1的晶體結(jié)構(gòu)也與GH32家族成員基本一致，與其他GH32家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)疊合對(duì)比顯示Cα原子的均方根偏差范圍為1.35～1.55?(圖2(d)).

圖2 INU1的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 The crystal structure of inulinase INU1(a)為INU1晶體的衍射圖；(b)非對(duì)稱單位中兩個(gè)INU1分子形成二聚體，分別為黃色和綠色顯示.圖中N-term和C-term標(biāo)示了每條鏈的N端和C端.每條鏈的Asn226結(jié)合有兩個(gè)以β(1→4)糖苷鍵聯(lián)接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)分子，顯示為青色；(c)為單個(gè)INU1分子結(jié)構(gòu)域；(d)為INU1與其他GH32家族蛋白結(jié)構(gòu)的比對(duì).圖中的PDB序列號(hào)3U75為西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)呋喃果糖苷酶，3KF5為S.occidentalis轉(zhuǎn)化酶，4EQV為S.cerevisiae轉(zhuǎn)化酶，1Y9M為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)外切菊粉酶，3SC7為無花果曲霉(Aspergillus ficuum)內(nèi)切菊粉酶.

圖3 INU1與呋喃果糖苷酶底物結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)比對(duì)立體視圖Fig.3 The cross-eye stereo view of the substrate binding pocket in INU1 and fructofuranosidase from S. occidentalis圖中INU1顯示為黃色，西方許旺酵母來源的呋喃果糖苷酶(PDB序列號(hào)3U15)顯示為綠色，由6個(gè)果糖形成的菊粉分子顯示為青色.圖中還標(biāo)示出了底物結(jié)合口袋周圍的重要氨基酸，氨基酸位置以INU1序列為參照.

3 討 論

我們嘗試在結(jié)晶條件中添加果糖和菊粉，但未能獲得INU1與底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu).在西方許旺酵母來源的呋喃果糖苷酶中，有結(jié)合底物菊粉的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)[24].將INU1與該結(jié)構(gòu)對(duì)比顯示，在底物結(jié)合口袋中與底物相互作用的氨基酸都是保守的(圖3，@@@486頁(yè)）.糖苷水解酶32家族的催化反應(yīng)一般由Blade Ⅰ結(jié)構(gòu)β1上的一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸作為親核試劑，Blade Ⅲ結(jié)構(gòu)β9上高度保守的Arg-Asp-Pro(RDP)基序起到穩(wěn)定催化過程中間態(tài)的作用，Blade Ⅳ結(jié)構(gòu)β13上的谷氨酸作為質(zhì)子供體(圖4，@@@486頁(yè)）[25-27].根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果，外切菊粉酶INU1的Asp53、Asp182和Glu238應(yīng)為主要的催化氨基酸，還有Asn52、Gln71、Trp79、Phe113、Ser114、Arg181、Asn273、Pro274和Trp335為與底物相互作用的氨基酸，其中Trp79、Phe113、Pro274和Trp335為提供疏水作用的氨基酸(圖3和圖4).

圖4 INU1與其他GH32家族蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.4 The amino acid sequence alignment of INU1 and others GH32 family proteins圖中黑色三角形為催化氨基酸，黑色圓圈為與底物有親水相互作用的氨基酸.

我們嘗試在結(jié)晶時(shí)加入菊粉作為底物，但在活性中心位置沒有找到明顯的底物或產(chǎn)物分子的電子云密度信號(hào).另外可能由于構(gòu)象不固定，在INU1結(jié)構(gòu)靠近糖基化基團(tuán)Asn226附近的第252到262位的一段環(huán)狀結(jié)構(gòu)沒有清晰的電子云密度.在這一區(qū)域附近，還有一些難以辨認(rèn)的電子云密度信號(hào)，它們可能是較長(zhǎng)的糖鏈分子，也可能是非特異結(jié)合的菊粉分子.