高級(jí)別膠質(zhì)瘤病人放化療前后淋巴細(xì)胞亞群變化及意義

張洋洋，高勁，陶振超，何健，楊麗萍，楊婧，周燕，黃一凡

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤（high grade glioma，HGG）約占腦膠質(zhì)瘤的77.5%［1］。手術(shù)聯(lián)合放化療可改善膠質(zhì)瘤病人預(yù)后［2］。但高級(jí)別膠質(zhì)病人的預(yù)后相對(duì)較差［3］。免疫功能失調(diào)是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素。有研究報(bào)道T淋巴細(xì)胞亞群與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)，術(shù)前CD4+/CD8+比值可評(píng)估預(yù)后［4］。但對(duì)于接受術(shù)后放化療的腦膠質(zhì)瘤病人仍缺乏有效的免疫評(píng)估指標(biāo)。本研究通過對(duì)51例HGG術(shù)后病人同步放化療前后淋巴細(xì)胞亞群變化的檢測(cè)，探討同步放化療對(duì)病人外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響以及CD4+/CD8+比值對(duì)評(píng)估HGG病人預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2012年6月至2017年7月安徽省腫瘤醫(yī)院頭頸放療科收治的HGG術(shù)后病人51例，所有納入病人均有影像學(xué)和病理診斷證實(shí)。同時(shí)排除HIV陽性、肝腎功能異常、預(yù)計(jì)生存期小于或等于3個(gè)月、合并嚴(yán)重疾病的病人。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病人年齡范圍為10～76歲，中位年齡44歲。其中男性23例，女性28例。年齡≤60歲45例，年齡＞60歲6例。病理Ⅲ級(jí)23例，病理Ⅳ級(jí)28例。KPS功能狀態(tài)評(píng)分＞70分38例，KPS評(píng)分≤70分13例。腫瘤最大徑≤5 cm 30例，腫瘤最大徑＞5 cm 21例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

1.2治療情況51例病人均接受基于MRI-CT融合的調(diào)強(qiáng)適形放射放療（intensity-modulated radiotherapy，IMRT）。GTV（大體腫瘤靶區(qū)）/GTVtb（大體腫瘤瘤床靶區(qū)）根據(jù)病人術(shù)前及術(shù)后MRI的T1增強(qiáng)和T2-FLAIR圖像進(jìn)行勾畫，包括瘤床及殘留腫瘤體積；CTV1為GTV外擴(kuò) 2～3 cm。CTV2為 GTV外擴(kuò)1 cm。PGTV/PGTVtb、PTV1、PTV2分別由GTV/GTVtb、CTV1、CTV2均勻外擴(kuò)3 mm。95%PGTV/PGTVtb：54～66 Gy/27～30 f（2.0～2.2 Gy/f），中 位 劑 量 60Gy；95%PTV1：47.6～54 Gy/27～30 f（1.7～2.0 Gy/f），中位劑量50Gy；95%PTV2：54～60.9Gy/27～30f（2.0～2.1Gy/f），中位劑量56 Gy。同期化療采用替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）（先靈葆雅公司，S016900）口服，劑量為75 mg·m-2·d-1。

1.3外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)分別抽取51例HGG病人放化療開始前1 d和放化療結(jié)束后第1天靜脈血3 mL，靜置1 h后立即送檢。采用美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀（型號(hào)BD FACSCALIBUR）檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群［CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、自然殺傷細(xì)胞（NK）、CD4+CD25+］水平。用流式細(xì)胞儀采集淋巴細(xì)胞窗內(nèi)5 000個(gè)細(xì)胞，Cellquest軟件計(jì)算標(biāo)記陽性細(xì)胞百分比。

1.4隨訪及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)放化療結(jié)束后第1年每3個(gè)月，第2～3年每6個(gè)月，第4年及以后每12個(gè)月復(fù)查1次顱腦MRI，評(píng)估腫瘤縮退情況。隨訪期間按照RANO標(biāo)準(zhǔn)（Response Assessment in Neuro-Oncology，神經(jīng)腫瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)）評(píng)價(jià)療效。采用無進(jìn)展生存率（progression-free survival，PFS）、總生存率（overall survival，OS）以及中位無進(jìn)展生存期（median progression-free survival，mPFS）和中位總生存期（median overall survival，mOS）作為觀察指標(biāo)，從手術(shù)當(dāng)天起算，終點(diǎn)事件為復(fù)發(fā)和死亡。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料中的計(jì)量資料，以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。生存分析模型為Kaplan-Meier法，兩組生存率比較為L(zhǎng)og-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1外周血淋巴細(xì)胞亞群水平比較51例HGG病人經(jīng)同步放化療后外周血CD4+CD25+水平及CD4+/CD8+比值較治療前均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD3+，CD4+，CD8+及NK細(xì)胞水平與放化療前后變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2生存率分析全組中位隨訪時(shí)間為14個(gè)月，范圍為2～60個(gè)月，2例失訪，隨訪率96.1%。mOS為20個(gè)月，1、2、3年總生存率分別為71.3%，43.3%，37.2%。mPFS為10個(gè)月，1、2、3年無進(jìn)展生存率分別為51.8%，38.3%，31.9%。

2.3單因素分析CD4+/CD8+比值對(duì)生存率的影響

采用Kaplan-Meier模型進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)顯示，41例同步放化療前CD4+/CD8+≥1組病人的mPFS及mOS分別為16個(gè)月和36個(gè)月，10例CD4+/CD8+＜1組mPFS及mOS分別為9個(gè)月和11個(gè)月，兩組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（mPFSP=0.004；mOSP=0.031）。見圖1，2。

3 討論

長(zhǎng)期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)因具有血腦屏障一直被認(rèn)為是免疫豁免區(qū)。但多項(xiàng)研究表明T淋巴細(xì)胞可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并同相應(yīng)的抗原結(jié)合，激活免疫應(yīng)答［5］。Dunn等［6］發(fā)現(xiàn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞均具有類抗原提呈細(xì)胞作用。在病理?xiàng)l件下，T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等可突破血腦屏障向腦內(nèi)浸潤(rùn)［7］，這些均提示腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。

T淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞亞群中最主要組分，而CD4+/CD8+比值是反映機(jī)體免疫功能的重要敏感指標(biāo)［8］。通常，在機(jī)體內(nèi)CD4+/CD8+比值處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，由此保證機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)病人免疫功能下降時(shí)，其CD4+/CD8+比值將低于正常值。有研究報(bào)道手術(shù)可提高膠質(zhì)瘤病人的CD4+/CD8+比值，改善病人免疫功能［9］。Campian等［10］報(bào)道放療聯(lián)合替莫唑胺可改變膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人外周血單核細(xì)胞水平，打破免疫平衡，傾向于免疫抑制。本研究檢測(cè)了HGG術(shù)后病人外周血淋巴細(xì)胞亞群于放化療前后的變化，結(jié)果顯示經(jīng)過同期放化療后CD4+/CD8+比值出現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示同期放化療可能會(huì)抑制T淋巴細(xì)胞功能，從而影響病人免疫功能。因此通過評(píng)估放化療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化，對(duì)于免疫功能下降的病人，盡早介入營(yíng)養(yǎng)支持與增強(qiáng)免疫功能治療可能會(huì)改善病人預(yù)后。

與此同時(shí)，本課題組發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞水平經(jīng)同步放化療后也出現(xiàn)下降。而CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中最重要的一類，具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特性［11］，能夠促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫耐受和逃逸。EL Andaloussi等［12］首次報(bào)道在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中CD4+CD25+T細(xì)胞浸潤(rùn)增加的同時(shí)，外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)目也隨之增加，換而言之，通過檢測(cè)外周血CD4+CD25+細(xì)胞水平可進(jìn)一步評(píng)估腫瘤組織浸潤(rùn)情況。

表1高級(jí)別膠質(zhì)瘤病人51例放化療前后淋巴細(xì)胞亞群水平比較/（%，±s）

表1高級(jí)別膠質(zhì)瘤病人51例放化療前后淋巴細(xì)胞亞群水平比較/（%，±s）

注：NK為自然殺傷細(xì)胞

時(shí)間放化療前放化療后t值P值CD4+CD25+12.47±3.95 10.22±2.44 4.931 0.000 CD3+63.40±15.19 64.80±15.24-0.618 0.540 CD3+CD4+34.49±7.78 32.19±8.23 1.989 0.052 CD3+CD8+27.97±11.28 30.89±9.82-1.955 0.056 CD4+/CD8+1.39±0.53 1.10±0.31 4.552 0.000 NK 23.08±8.98 23.68±19.36-0.220 0.827

圖2 CD4+/CD8+比值≥1與CD4+/CD8+比值＜1高級(jí)別膠質(zhì)瘤51例總生存曲線比較

結(jié)合本組外周血檢測(cè)結(jié)果，同步放化療在一定程度上降低了膠質(zhì)瘤病人的CD4+CD25+T細(xì)胞水平，降低了免疫抑制作用，防止腫瘤細(xì)胞的免疫逃避，對(duì)改善預(yù)后起著促進(jìn)作用。但其發(fā)生機(jī)制可能需要進(jìn)一步闡明。

影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的臨床因素有病理的分級(jí)、手術(shù)的切除范圍、年齡以及KPS評(píng)分等［13-14］。但目前依然缺乏對(duì)同步放化療療效的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。Shi等［15］研究發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值與腦膠質(zhì)瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)性，CD4+/CD8+比值越低，腫瘤惡性度越高，免疫抑制作用越明顯，機(jī)體對(duì)腫瘤的抑制能力越差，由此可能會(huì)影響病人的預(yù)后。鑒于腫瘤發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫應(yīng)答密切相關(guān)，本研究進(jìn)一步探討了同步放化療前外周血CD4+/CD8+比值與預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示CD4+/CD8+比值是影響HGG術(shù)后病人PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因素，CD4+/CD8+≥1的病人預(yù)后要優(yōu)于CD4+/CD8+＜1的病人，這與徐春華等［16］的研究結(jié)果基本一致?？梢?，放化療前CD4+/CD8+比值低的病人，免疫功能低下，術(shù)后復(fù)發(fā)、進(jìn)展時(shí)間相對(duì)較早，導(dǎo)致生存時(shí)間縮短，影響預(yù)后。

此外，研究者發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)在很大程度上取決于為數(shù)不多的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。這些細(xì)胞具有很強(qiáng)的DNA修復(fù)、抗凋亡、自我更新及多項(xiàng)分化能力，這使得放化療均不敏感［17］。Yao等［18］發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤病人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的比例明顯增高，而后者可抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避可能。因此，對(duì)于那些放化療不敏感或復(fù)發(fā)的HGG病人，需要我們更加關(guān)注機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。盡早的有效評(píng)估病人免疫功能，及時(shí)介入免疫增強(qiáng)治療可能會(huì)提高病人的生存期。

綜上所述，同期放化療降低了HGG病人外周血CD4+CD25+細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值。CD4+/CD8+比值低的病人，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，生存期較短，預(yù)后較差。放化療前CD4+/CD8+比值可以作為評(píng)價(jià)HGG術(shù)后病人預(yù)后的有效指標(biāo)。