三葉苷對N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

周芮萱，馬松濤，蔣剛

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stoke）具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的臨床常見疾?。?-2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有150萬人發(fā)病，其中1/3的病人因此死亡，1/3的病人導(dǎo)致長期殘疾，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量［3］。因此，尋求有效的藥物預(yù)防和治療缺血性腦卒中刻不容緩。

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體是谷氨酸鹽受體家族中的一員，是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的離子型受體。正常生理?xiàng)l件下，NMDA受體參與并維持多種神經(jīng)系統(tǒng)功能。但在生理病變條件下，NMDA受體被過度激活，引起興奮性神經(jīng)毒性，從而導(dǎo)致缺血性腦卒中疾病的發(fā)生。正因如此，NMDA受體成為了治療缺血性腦卒中的重要靶點(diǎn)。三葉苷是是多穗柯嫩葉的甜味主要成分，具有顯著降低血脂，減輕體質(zhì)量，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，清除自由基的作用［4］。目前有研究報道提示，三葉苷具有抗腦缺血作用，但其分子機(jī)制不夠明確［5］，因此，本研究于2015年11月至2016年7月通過建立體外興奮性毒性損傷模型，探究三葉苷的保護(hù)作用，并進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1主要試劑三葉苷購自成都Biopurify公司（批號PRF15092821）；NMDA和乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國Amresco公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰酶和四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma公司；N-（2-羥乙基）哌嗪-N-乙磺酸鈉（HEPES）購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；乳酸脫氫酶（LDH）定量檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；凋亡蛋白Bcl-2，Bax抗體，美國Santa Cruz公司；NR2B亞基蛋白抗體，美國CST公司；鼠β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔，羊抗鼠二抗購自上海中杉金橋；RIPA蛋白裂解液由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.2主要儀器日本SANYO HF90二氧化碳培養(yǎng)箱；日本Olympus IX53光學(xué)倒置顯微鏡；美國BIOTEK ELx800酶標(biāo)測試儀。

1.3細(xì)胞株人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）株由沈陽藥科大學(xué)惠贈。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液，含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素雙抗。于5%二氧化碳，37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測三葉苷對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1.0×105/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，于5%二氧化碳，37 °C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為25，50，100和200 μmol/L的三葉苷100 μL培養(yǎng)24 h，然后向每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL（終濃度約0.5 mg/mL），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，孵育結(jié)束后，棄去上清液，向每孔中加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），震搖5 min，于酶標(biāo)儀490 nm處測定其吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.3NMDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的建立

采用NMDA（0 μmol/L，1 μmol/L，2 μmol/L，5 μmol/L）共孵30 min，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用MTT法檢測細(xì)胞損傷模型的建立。

1.4.4MTT法檢測三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SHSY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用 取細(xì)胞損傷模型對數(shù)生長期細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1.0×105/mL的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，于5%二氧化碳，37°C 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為0，10，50，100 μmol/L的三葉苷孵育4 h，按1.4.3建立三葉苷干預(yù)細(xì)胞損傷模型，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.5三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放量的影響 細(xì)胞分組及培養(yǎng)同1.4.4，按照LDH試劑盒操作要求進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測定在490 nm的吸光度，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4.6三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2及NMDA受體調(diào)節(jié)亞單位NR2B蛋白表達(dá)，采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。每組按20 μL蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，將一抗的抗體按照說明書用封閉液配制至適當(dāng)?shù)臐舛龋?℃孵育過夜。各個抗體稀釋的倍數(shù)如下：Bcl-2（1∶600），Bax（1∶600），β-actin（1∶1000），NR2B（1∶1000）。次日用等滲緩沖鹽溶液（TBST）漂洗膜3次，每次5 min。將二抗按1∶8 000比例用TBST稀釋，室溫下孵育1 h。用TBST漂洗膜3次，每次10 min，最后以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，β-actin作為內(nèi)參，采用Image J灰度分析軟件，對所得蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，利用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，兩組間比較應(yīng)用成組t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三葉苷對SH-SY5Y細(xì)胞生長的影響通過MTT法檢測三葉苷對SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，三葉苷組在0～100 μmol/L范圍內(nèi)對SHSY5Y細(xì)胞的生長無明顯影響，在200 μmol/L濃度時，細(xì)胞存活率為（86.46±2.01）%，開始對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用，與對照組（0 μmol/L三葉苷）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此本研究選擇10，50，100 μmol/L作為后續(xù)活性測試濃度。

2.2NMDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的建立采用MTT法檢測NMDA對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示，1，2，5 mmol/L NMDA誘導(dǎo)下的細(xì)胞存活率分別為（82.99±3.13）%，（53.13±3.31）%，（26.34±1.97）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=262.1，P＜0.001）。隨著NMDA濃度的增加，對細(xì)胞的抑制作用也逐步開始增加。2 mmol/L的NMDA造模30 min，對細(xì)胞抑制率達(dá)到50.00%左右，因此選用2 mmol/L的NMDA為造模濃度。

2.3MTT法檢測三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響采用MTT法初步檢測確定三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NMDA（2 mmol/L，30 min）誘導(dǎo)損傷的模型中，NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組細(xì)胞存活率為（53.51±2.07）%；在三葉苷濃度為10，50，100 μmol/L的條件下，細(xì)胞存活率分別 為（56.28±2.05）% 、（68.64±1.74）% 、（75.98±1.84）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293.3，P＜0.001），說明三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用具有濃度依賴性。

2.4三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放量的影響LDH釋放量法可間接反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)，采用LDH法再次證明了三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NMDA增加了細(xì)胞凋亡，NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組細(xì)胞凋亡率達(dá)到了（52.50±1.97）%，與對照組（0 mmol/L NMDA）細(xì)胞凋亡率（10.29±2.11）%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=58.93，P＜0.001）；不同濃度的三葉苷（10，50，100 μmol/L）能減少細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為（39.80±1.76）%、（31.13±2.21）%、（22.18±2.52）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=314.1，P＜0.001），表明三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.5三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響B(tài)ax和Bcl-2是細(xì)胞內(nèi)與凋亡關(guān)系密切的蛋白，細(xì)胞發(fā)生凋亡時，凋亡蛋白Bax表達(dá)量上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降。從圖1可知，與對照組（0 mmol/L NMDA）細(xì)胞蛋白Bax表達(dá)量（0.044±0.003）、蛋白Bcl-2表達(dá)量（1.290±0.051）、NR2B蛋白表達(dá)（0.068±0.003）相比，NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組細(xì)胞蛋白Bax表達(dá)量（0.270±0.016）明顯升高（t=24.64，P＜0.001），蛋白Bcl-2表達(dá)量（0.790±0.028）下降（t=15.65，P＜0.001），NR2B蛋白表達(dá)（0.340±0.019）明顯增加（t=24.89，P＜0.001）。與NMDA損傷模型（0 μmol/L三葉苷）組相比，三葉苷（10，50，100 μmol/L）組細(xì)胞蛋白Bax表達(dá)量（0.300±0.020）、（0.200±0.015）、（0.110±0.002）隨藥物濃度的增加逐漸減少（均P＜0.01），蛋白Bcl-2表達(dá)量（1.100±0.028）、（1.240±0.062）、（1.400±0.047）明顯升高（均P＜0.001），NR2B蛋白表達(dá)（0.190±0.013）、（0.160±0.160）、（0.120±0.006）隨藥物濃度的增加逐漸減少（均P＜0.001）。

圖1 三葉苷對NMDA誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞蛋白（NR2B、Bax和Bcl-2）表達(dá)的影響（蛋白質(zhì)印跡法）

3 討論

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國年齡標(biāo)化的卒中患病率為1 115/10萬，每年的年齡標(biāo)化發(fā)病率為247/10萬，死亡率為115/10萬［6］。目前，腦卒中已經(jīng)成為我國第1位的致死原因。缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，由神經(jīng)興奮性毒性、鈣離子超載、再灌注損傷、酶系統(tǒng)激活、細(xì)胞凋亡等共同參與，最終引起細(xì)胞死亡［7］。發(fā)病過程是由于腦供血不足使腦細(xì)胞失去能量及氧氣的供應(yīng)，從而導(dǎo)致興奮性氨基酸（EAA）谷氨酸大量釋放，使NMDA受體被過度激活，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［8］。由此可見，NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性和鈣離子超載是缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的觸發(fā)者。而腦缺血發(fā)生后，在致死區(qū)和正常區(qū)之間存在半暗帶，這個區(qū)域可保持一定量的血流以維持新陳代謝［9］。缺血中心區(qū)和缺血半暗帶的細(xì)胞損傷和死亡方式具有明顯的差異，在缺血中心區(qū)，細(xì)胞是以急性壞死為主要方式，具有不可逆性；而半暗帶細(xì)胞的凋亡需要鈣離子、細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制、基因轉(zhuǎn)錄等參與，具有潛在可挽救性［10］。目前，研究發(fā)現(xiàn)，選擇性NMDA受體拮抗劑可起到神經(jīng)保護(hù)的作用，挽救缺血半暗帶部分殘留的尚具活力的可逆性損傷神經(jīng)元和腦組織，且具有臨床應(yīng)用的可能［11］。NMDA受體為興奮性氨基酸谷氨酸的離子型受體，具有異四聚體結(jié)構(gòu)，由NR1，NR2，NR3及NR4等亞單位組成，NR1是基本的功能亞單位，NR2是重要的調(diào)節(jié)亞單位，有NR2A，NR2B，NR2C，NR2D等4個不同的亞型［12-14］。近期研究表示，不同類型的NR2亞單位構(gòu)成的NMDA受體對神經(jīng)損傷表現(xiàn)出不同的作用，含有NR2B的NMDAR及其介導(dǎo)的信號分子在興奮毒性和缺血引起的神經(jīng)元死亡中起主要作用15］。當(dāng)NMDA-NR2B亞基被激活時，大量鈣離子內(nèi)流，從而激活一系列的酶系統(tǒng)，最終引起細(xì)胞死亡。研究結(jié)果顯示，隨著三葉苷藥物濃度的增加，NMDA-NR2B蛋白的表達(dá)逐漸減少，說明三葉苷對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制與NMDA-NR2B亞單位相關(guān)。

NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性和鈣離子超載是缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的觸發(fā)者，本研究結(jié)果表明，三葉苷對NMDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。NMDA刺激SH-SY5Y細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，NMDA受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性將導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡［16-17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三葉苷能減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可以降低NMDA誘導(dǎo)的LDH釋放量的增加。三葉苷通過上調(diào)Bcl-2，抑制Bax表達(dá)達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用，以上研究結(jié)果表明三葉苷可以抑制NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性的發(fā)生，可挽救缺血半暗帶部分殘留的尚具活力的可逆性損傷神經(jīng)元和腦組織，為三葉苷在缺血性腦卒中的防治方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究僅僅表明三葉苷的作用機(jī)制與NMDA-NR2B亞單位相關(guān)，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。