吡格列酮對三硝基苯磺酸誘導(dǎo)炎癥性腸病大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ和核因子-κB p65的影響

葛相栓，劉小玲，王慧超，李君芳

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一類多種病因引起的、異常免疫介導(dǎo)的腸道慢性及復(fù)發(fā)性炎癥。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPAR-γ）具有炎癥調(diào)控作用。本研究于2006年9月至2007年8月將PPAR-γ配體吡格列酮干預(yù)三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的IBD大鼠，通過觀察大鼠的疾病活動度和結(jié)腸黏膜損傷情況并檢測結(jié)腸PPAR-γ，核因子-κB p65（NF-κB p65）表達(dá)，探討吡格列酮對大鼠IBD可能的作用機(jī)制和治療效果，為其今后應(yīng)用于IBD臨床治療提供理論依據(jù)。

圖1 對照組、模型組及干預(yù)組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）和核因子-κB p65（NF-κB p65）的表達(dá)：A、B、C分別是對照組、模型組及中劑量干預(yù)組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)（HE染色×40）；D、E、F、G分別是模型組及中劑量干預(yù)組PPAR-γ與NF-κB p65的表達(dá)（免疫組織化學(xué)SP法×100）

1 材料與方法

1.1實驗動物3月齡清潔級大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度18～22℃，相對濕度50%～60%，光照12 h/d，自由飲水，飼喂鼠全價飼料，隔日更換墊料。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

1.2主要試劑及儀器鹽酸吡格列酮片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號040525，規(guī)格：30 mg；柳氮磺吡啶（SASP），上海信誼天平藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號06181105，規(guī)格：15 mg；兔抗鼠PPAR-γ多克隆抗體，上海鈺博生物科技有限公司，濃度：1 mg/mL；羊抗兔過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素（SP）染色試劑盒，北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗NF-κB p65單克隆抗體，艾美捷科技有限公司，羊抗兔SP試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNBS，上海榕柏生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：10 mL；圖像采集系統(tǒng)，美國PixeLINK1394 camera公司。

1.3實驗設(shè)計

1.3.1分組 48只SD大鼠稱體質(zhì)量后編號，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、SASP藥物治療組（SASP組）、吡格列酮低劑量治療組（低劑量組）、吡格列酮中劑量治療組（中劑量組）、吡格列酮高劑量治療組（高劑量組），每組8只，其中后四組為干預(yù)組。

1.3.2模型構(gòu)建 TNBS/乙醇溶液（5%TNBS溶于50%乙醇中，體積比2∶1）法構(gòu)建模型。原理：乙醇破壞結(jié)腸黏膜屏障，TNBS與腸黏膜角蛋白結(jié)合，激發(fā)局部的免疫反應(yīng)，引起局部出血、水腫，糜爛，形成潰瘍，詳細(xì)過程參考文獻(xiàn)［1］。對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌腸，其余各組均TNBS/乙醇溶液進(jìn)行結(jié)腸炎模型構(gòu)建。

1.3.3各組處置 對照組、模型組：0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次；吡格列酮低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別予吡格列酮2 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg灌胃，每日1次；SASP組：給予SASP 100 mg/kg灌胃，每日1次。均于造模后第2天開始灌胃。

1.3.4標(biāo)本采集 飼養(yǎng)14 d后開腹暴露腹主動脈，負(fù)壓管采取血液，低速離心后留血清，-75℃保存。游離結(jié)腸組織，取病變最明顯處組織，應(yīng)用4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋。

1.4免疫組織化學(xué)檢測免疫組織化學(xué)法檢測大鼠結(jié)腸組織NF-κB p65、PPAR-γ蛋白的表達(dá)，操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作為陰性對照。切片集中染色。染色及結(jié)果判定：NF-κB p65、PPAR-γ陽性表達(dá)均為細(xì)胞核內(nèi)和（或）胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下盲法讀片，觀察陽性染色在胞質(zhì)、胞核的分布。每張切片任意選擇5個100倍視野，采用病理圖像分析系統(tǒng)分析陽性細(xì)胞積分光密度值。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1結(jié)腸炎癥活動指數(shù)（DAI） 觀察動物體質(zhì)量下降比例、大便性狀及血便的改變，按照結(jié)腸炎癥活動評分標(biāo)準(zhǔn)［2］，代入公式DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）／3，計算大鼠的炎癥活動。

1.5.2結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI） 肉眼觀察結(jié)腸黏膜的充血、水腫、壁內(nèi)潰瘍、腸壁厚度及腸管長度的改變，參照Wallace、Keenan［3］結(jié)腸黏膜大體損傷評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸黏膜大體損傷評分。

1.5.3結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷指數(shù)（TDI） 顯微鏡下觀察組織切片有無潰瘍、淋巴細(xì)胞浸潤、嗜中性粒細(xì)胞浸潤及浸潤深度、黏蛋白減少、假膜形成等11項指標(biāo)，進(jìn)行評分，具體評分細(xì)則參照Pullan等［4］組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)。上述評分均由病理科醫(yī)師采用盲法進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析處理。不同組別間的數(shù)值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。NF-κB p65、PPARγ表達(dá)水平雙變量間的單因素相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸DAI不同組間均數(shù)比較，F(xiàn)=8.495，P=0.000。SASP組、吡格列酮低、中及高劑量組DAI與模型組比較，均低于模型組，P值分別是0.000、0.010、0.000、0.010；中劑量治療組與SASP組比較，P=0.6900，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；吡格列酮低劑量治療組、高劑量組DAI與SASP組比較，P值分別是0.020、0.020，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。具體數(shù)值見表1。

2.2結(jié)腸黏膜CMDI對照組、模型組、SASP組、低劑量組、中劑量組、高劑量組結(jié)腸長度分別為（9.01±0.01）cm、（8.95±0.01）cm、（9.10±0.20）、（9.21±0.15）cm、（8.97±0.17）cm、（9.00±0.05）cm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.120。不同組間均數(shù)比較，F(xiàn)=7.057，P=0.000。SASP組、吡格列酮低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組比較顯著低于模型組，P值分別是0.000、0.001、0.000、0.005。吡格列酮不同劑量治療組與SASP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別是0.456、1.000、0.1400。具體數(shù)值見表1。

2.3結(jié)腸黏膜TDI不同組間均數(shù)比較，F(xiàn)=20.573，P=0.000。SASP組、吡格列酮低劑量組、中劑量治療組、高劑量治療組與模型組TDI比較，均P=0.000，低于模型組。吡格列酮不同劑量治療組與SASP藥物組比較，P值分別是0.568、0.849、0.568，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。具體數(shù)值見表1。

2.4結(jié)腸NF-κBp65、PPAR-γ檢測

2.4.1對照組可見大量PPAR-γ陽性顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)；不同組間PPAR-γ均數(shù)比較，F(xiàn)=47.101，P=0.000。模型組PPAR-γ表達(dá)顯著低于對照組，P=0.000；SASP組、吡格列酮低劑量組、中劑量組、高劑量組PPAR-γ表達(dá)顯著高于模型組，均P=0.000，陽性顆粒主要位于腸上皮細(xì)胞和部分炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核；吡格列酮低劑量組、中劑量組、高劑量組PPAR-γ與SASP組相比較，P值分別是0.000、0.773、0.004。

不同組間NF-κB p65均數(shù)比較，F(xiàn)=105.725，P=0.000。對照組NF-κB p65陽性細(xì)胞少見，以胞質(zhì)表達(dá)為主；模型組可見大量腸上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核中有NF-κB p65陽性顆粒分布，表達(dá)顯著高于對照組，P=0.000；SASP組、吡格列酮低劑量組、中劑量組、高劑量組PPAR-γ表達(dá)顯著低于模型組，均P=0.000。吡格列酮中、高劑量組與SASP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別是0.370、0.952。具體數(shù)值見表2及圖1。

表1 不同組別大鼠結(jié)腸組織炎癥活動指數(shù)（DAI）、大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）、組織學(xué)損傷指數(shù)（TDI）的比較/±s

表1 不同組別大鼠結(jié)腸組織炎癥活動指數(shù)（DAI）、大體形態(tài)損傷指數(shù)（CMDI）、組織學(xué)損傷指數(shù)（TDI）的比較/±s

注：DAI（炎癥活動指數(shù)）中a示與模型比較，P值分別是0.001、0.010、0.002、0.009；b示與SASP組比較，P值分別是0.019、0.687、0.020；CMDI（大體形態(tài)損傷指數(shù)）中c示與模型比較，P值分別是0.000、0.001、0.000、0.005；d示與SASP組比較，P值分別是0.456、1.000、0.140；TDI（組織學(xué)損傷指數(shù)）中e示與模型比較，均P=0.000；f示與SASP組比較，P值分別是0.568、0.849、0.568

組別模型組SASP組低劑量組中劑量組高劑量組F值P值鼠數(shù)8 8 8 8 8 DAI 3.13±0.83 1.50±0.53a 2.25±0.71ab 1.63±0.52ab 2.25±0.46ab 8.495 0.000 CMDI 2.63±0.52 1.13±0.83c 1.38±0.52cd 1.13±0.83cd 1.63±0.84cd 7.057 0.000 TDI 9.50±1.93 4.63±1.19e 5.00±1.31ef 4.75±1.04ef 4.00±0.76ef 20.573 0.000

表2 不同組別大鼠結(jié)腸組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）及核因子-κB p65［NF-κB p65］的比較/±s

表2 不同組別大鼠結(jié)腸組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）及核因子-κB p65［NF-κB p65］的比較/±s

注：PPAR-γ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）中a示與對照組比較，P=0.000；b示與模型比較，均P=0.000；c示與SASP組比較，P值分別是0.000、0.773、0.004。NF-κB p65［核因子-κB p65］中d示與對照組比較，P=0.000；e示與模型比較，均P=0.000；f示與SASP組比較，P值分別是0.001、0.370、0.952

組別對照組模型組SASP組低劑量中劑量高劑量F值P值鼠數(shù)88 8 8 8 8 PPAR-γ 46.62±3.07 27.24±2.71a 39.79±1.39ab 34.62±2.26abc 40.13±2.23abc 36.22±2.11abc 47.101 0.000 NF-κB p65 17.48±0.84 33.74±1.56d 22.18±2.08de 19.28±1.32def 21.46±1.76def 22.13±1.58def 105.725 0.000

2.4.2NF-κB p65、PPARγ關(guān)聯(lián)性分析 對照組、模型組、SASP組、吡格列酮低劑量組、中劑量組、高劑量組PPAR-γ與NF-κB p65的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為-0.851、-0.875、-0.771、-0.776、-0.766、-0.910，P值分別是 0.007、0.004、0.025、0.024、0.027、0.000）。

3 討論

目前認(rèn)為IBD的發(fā)病與環(huán)境因素、免疫、遺傳、感染等多種因素有關(guān)，腸道免疫系統(tǒng)導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥過程?；罨拿庖呒?xì)胞，如單個核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞經(jīng)刺激后合成或分泌的細(xì)胞因子在IBD的發(fā)病機(jī)制中起重要的調(diào)節(jié)作用，其中促炎和抗炎細(xì)胞因子失衡在IBD發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用［5］。免疫是目前IBD研究的熱點。

NF-κB是一種參與炎癥、免疫反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，許多分子都受NF-κB的調(diào)控，如TNF（腫瘤壞死因子）-α、IL（白細(xì)胞介素）-1β、IL-8、IL-12、IL-2、IL-6、iNOS（誘導(dǎo)型一氧化氮合酶）、COX2（環(huán)氧酶2）、炎癥趨化因子、黏附分子［5］。NF-κB活化通過兩種主要的信號通路：經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路。經(jīng)典的NF-κB激活途徑來自不同免疫受體的刺激，激活程度是快速且短暫的，而非經(jīng)典途徑是緩慢且持久的［6］。NF-κB在克羅恩病病人巨噬細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，促使結(jié)腸上皮細(xì)胞促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，腸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。而作為NF-κB拮抗劑的二硫代氨基甲酸吡咯烷，通過降低NF-κB活性來緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥［7］。上述研究表明NF-κB在IBD中的促炎作用。NF-κB p65作為NF-κB家族成員之一，本研究發(fā)現(xiàn)TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型中NF-κB p65的表達(dá)較同期正常對照組明顯增高，給予SASP及吡格列酮干預(yù)后不同程度降低。這印證了上述觀點。

PPAR-γ是介導(dǎo)脂肪酸及過氧化物酶體增殖物，分別在巨噬細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞及其它種類的免疫細(xì)胞上表達(dá)，在健康的大腸上皮細(xì)胞上高表達(dá)，而在IBD中低表達(dá)［8］。在克羅恩病病人和TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，PPAR-γ水平下降［9］，表達(dá)PPAR-γ的基因載體或PPAR-γ激動劑（吡格列酮和姜黃素）能降低不同結(jié)腸炎模型的黏膜炎癥和疾病的嚴(yán)重程度。相反，破壞結(jié)腸PPAR-γ的表達(dá)能使化學(xué)藥物誘導(dǎo)結(jié)腸炎的敏感性增加。本研究中結(jié)腸炎模型組PPAR-γ下降，給予吡格列酮及SASP干預(yù)后不同程度升高，與上述研究一致，表明PPAR-γ參與了IBD的炎癥反應(yīng)過程。

PPAR-γ主要通過抑制炎癥通路中NF-κB、AP-1、STAT及NFAT等轉(zhuǎn)錄因子的活性來發(fā)揮抗炎作用［10-11］。Yang等［9］研究表明TNBS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型中CMDI、DAI、NF-кB、TNF-α、IL-6、MPO（髓過氧化物酶）等升高，PPAR-γ降低，給予穿心蓮內(nèi)酯衍生物干預(yù)后，前者下降、后者升高［12］。研究顯示含有吡唑的中氮茚衍生的化合物B4能通過激活PPAR-γ的表達(dá)來抑制NF-κB活化，緩解TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠的癥狀，包括體質(zhì)量下降、腸道病理損傷及炎癥細(xì)胞的浸潤。相反，PPAR-γ拮抗劑GW9662能抑制 B4的抗炎效果［7］。Wang等［13］研究表明在葡聚糖硫酸酯鈉誘導(dǎo)鼠實驗性結(jié)腸炎，千層紙素苷通過PPARγ激活來抑制NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。本研究表明，給予PPAR-γ配體吡格列酮后PPAR-γ表達(dá)升高，而NF-κB p65表達(dá)下降。這說明實驗性結(jié)腸炎中NF-κB和PPAR-γ負(fù)相關(guān)，其相互關(guān)系為：PPAR-γ的活化能抑制NF-κB下游信號表達(dá)，從而減輕腸道炎癥。

吡格列酮是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類降糖藥。早期研究表明噻唑烷二酮類藥物對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有治療作用［14］。羅格列酮作為PPAR-γ的配體能調(diào)控單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中多種細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-1β，COX-2，IL-6，IL-8，TNF-α，INF（干擾素）-γ，iNOS和炎癥趨化因子的表達(dá)，減輕腸道炎癥，特別是NF-кB的表達(dá)［15-16］。梁紅亮和歐陽欽［17］在惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)羅格列酮治療后PPAR-γ表達(dá)陽性率隨時間的延長而逐漸增高，NF-κB p65、Fas/Fasl和Caspase-3表達(dá)陽性率隨時間的延長而逐漸遞減，說明PPAR-γ配體噻唑烷二酮類通過激活PPAR-γ來抑制NF-κB活化，從而緩解結(jié)腸炎癥。本研究中吡格列酮干預(yù)實驗與上述結(jié)論一致。

總之，本實驗顯示吡格列酮可有效改善TNBS誘導(dǎo)的IBD大鼠的癥狀，其作用機(jī)制可能是吡格列酮作為PPAR-γ人工配體，通過增加PPAR-γ的表達(dá)，抑制促炎因子NF-κB p65的表達(dá)，減輕結(jié)腸的炎癥和免疫反應(yīng)。同時，本研究也為吡格列酮治療結(jié)腸炎提供了一定理論依據(jù)。

志謝中國科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科吳正祥教授及河南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院喬玲教授在本研究設(shè)計、指標(biāo)檢測、論文書寫及數(shù)據(jù)統(tǒng)計等方面給予耐心、詳盡的指導(dǎo)

（本文圖1見插圖10-1）