仙靈密骨顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

劉群，邱少華，林曉

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101：2.臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276000)

本品是由續(xù)斷、淫羊藿等味藥材經(jīng)合理的工藝提取得到的顆粒劑，具補(bǔ)腎益精、強(qiáng)筋健骨、活血通絡(luò)之功效，用于骨質(zhì)疏松癥中證屬“腎虛絡(luò)瘀”者。其中淫羊藿，又名仙靈脾，能溫腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，為方中君藥[1]?，F(xiàn)代藥理研究亦表明，淫羊藿苷作為淫羊藿的主要有效成分，能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[2]。為了能科學(xué)有效地控制本品的內(nèi)在質(zhì)量，本研究選擇淫羊藿苷作為高效液相色譜(HPLC)含量測(cè)定指標(biāo)，同時(shí)對(duì)雞血藤、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、千年健進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別研究，建立了仙靈密骨顆粒的定性定量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，包括VWD檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站)；Mettler Toledo AG285電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，160 W，40 kHz)；硅膠G薄層板(青島海浪硅膠干燥劑有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)：0737-200011)、柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)：722-200107)、川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品(批號(hào)：111685-200401)、雞血藤對(duì)照藥材(批號(hào)：121173-200402)、千年健對(duì)照藥材(批號(hào)：121571-201202)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。顆粒樣品3批(批號(hào)：100104、100108和100112)。乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、三氯甲烷及其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 雞血藤[3]取本品8 g，研細(xì)，加甲醇60 mL，回流提取1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)訜崴?0 mL使溶解，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含雞血藤的陰性制劑，同法制成雞血藤陰性對(duì)照溶液。再取雞血藤對(duì)照藥材5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中國(guó)藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。從圖1中可以看出，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相同顏色的熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照液對(duì)雞血藤的鑒別無(wú)干擾，該法簡(jiǎn)便，快速，并具有良好的專屬性。

1、4.雞血藤對(duì)照藥材溶液；2.陰性對(duì)照液；3.供試品溶液圖1 雞血藤的TLC鑒別色譜圖

2.1.2 淫羊藿、骨碎補(bǔ)[3-4]取上述“2.1.1”項(xiàng)下三氯甲烷提取后的水液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另分別取不含淫羊藿和不含骨碎補(bǔ)的陰性制劑，同法制成淫羊藿陰性對(duì)照溶液和骨碎補(bǔ)陰性對(duì)照溶液。再取淫羊藿苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[《中國(guó)藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置105 ℃烘箱中加熱5 min，取出，置紫外光燈(365 nm)下檢視。從薄層色譜圖(見(jiàn)圖2)上可以看出，供試品色譜中，在與淫羊藿苷和柚皮苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相同顏色的熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照液對(duì)淫羊藿苷和柚皮苷的鑒別無(wú)干擾，該法具有良好的專屬性。

1.淫羊藿苷；2.缺淫羊藿陰性對(duì)照液；3.供試品溶液；4.缺骨碎補(bǔ)陰性對(duì)照液；5.柚皮苷?qǐng)D2 淫羊藿、骨碎補(bǔ)的TLC鑒別色譜圖

2.1.3 續(xù)斷[5-6]取“2.1.2”項(xiàng)下乙酸乙酯提取后的水液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨水層，正丁醇層再用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，加中性氧化鋁(100～200目)1 g拌勻，揮干溶劑，加于中性氧化鋁柱(100～200目，7 g，d=1.5 cm，干法裝柱)上，用水30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含續(xù)斷的陰性制劑，同法制成續(xù)斷陰性對(duì)照溶液。再取川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[《中國(guó)藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以0.5% NaOH溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。從薄層色譜圖(見(jiàn)圖3)上可以看出，供試品色譜中，在于對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照液對(duì)川續(xù)斷皂苷VI的鑒別無(wú)干擾，該法簡(jiǎn)便，快速，并具有良好的專屬性。

1、4.川續(xù)斷皂苷VI對(duì)照品；2.陰性對(duì)照液；3.供試品溶液圖3 續(xù)斷的TLC鑒別色譜圖

2.1.4 千年健[7]取本品8 g，研細(xì)，置250 mL圓底燒瓶中，加水100 mL，搖勻，上接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水使充滿其刻度部分，再于刻度管中加入乙酸乙酯4 mL，連接回流冷凝管，加熱至沸，蒸餾1 h，分取乙酸乙酯層，作為供試品溶液。另取不含千年健的陰性制劑，同法制成千年健陰性對(duì)照溶液。再取千年健對(duì)照藥材2 g,加乙醚20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中國(guó)藥典》2015年版(四部)通則0502]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。從薄層色譜圖(見(jiàn)圖4)上可以看出，供試品色譜中，在于千年健對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照液在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照液對(duì)千年健的鑒別無(wú)干擾，結(jié)果表明，該法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)。

1、4.千年健對(duì)照藥材；2.陰性對(duì)照液；3.供試品溶液圖4 千年健的TLC鑒別色譜圖

2.2 淫羊藿苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算不低于2 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.105 6 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，濾過(guò)，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)?0%的甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例，取除淫羊藿以外的其他處方量藥材，按處方制劑工藝同法制備缺淫羊藿的陰性對(duì)照樣品，取陰性對(duì)照樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下同法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明陰性樣品在淫羊藿苷出峰位置上無(wú)雜質(zhì)峰，表明處方中其他藥味對(duì)淫羊藿苷的含量測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖5)。

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照 1.淫羊藿苷?qǐng)D5 淫羊藿苷HPLC色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置于2 mL量瓶中，以50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為Y=19.833×103X-6.223(r=0.999 9)，表明淫羊藿苷在進(jìn)樣濃度0.015 84～0.079 20 mg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.6”項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液(濃度為0.047 52 mg·mL-1)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積RSD為0.11%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、1、2、4、6、8 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定淫羊藿苷峰面積。結(jié)果峰面積RSD為0.69%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)測(cè)定是穩(wěn)定的。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：100108)6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷平均含量為1.260 mg·g-1，RSD為0.32%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品(批號(hào)：100108，淫羊藿苷含量為1.260 mg·g-1)6份，每份1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 樣品測(cè)定 取上述3批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每批平行測(cè)定2次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批顆粒中淫羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜條件的選擇 在對(duì)處方中雞血藤、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷4味藥材進(jìn)行TLC定性鑒別時(shí)，根據(jù)上述藥材所含化學(xué)成分的性質(zhì)差異，在供試樣品制備中，實(shí)現(xiàn)了以同一份樣品的三氯甲烷部位用于雞血藤鑒別，乙酸乙酯部位用于淫羊藿、骨碎補(bǔ)鑒別，正丁醇部位用于續(xù)斷鑒別的實(shí)驗(yàn)操作，也可減少試劑對(duì)環(huán)境的污染。其中在雞血藤供試品處理上，把樣品的三氯甲烷提取液蒸干后，芒柄花素在熱水中溶解較好，所以以熱水溶解，濾過(guò)，可除去大量葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，減少了干擾，使斑點(diǎn)顯色更為清晰；在其展開(kāi)劑的選擇上，參考《中國(guó)藥典》[3]，并把三氯甲烷-甲醇比例由10∶1調(diào)整為20∶1，使得薄層斑點(diǎn)間分離度進(jìn)一步得到改善。在續(xù)斷供試品處理上，參考文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，選擇鑒別續(xù)斷中的有效成分川續(xù)斷皂苷VI，并通過(guò)甲醇回流提取，三氯甲烷、乙酸乙酯脫脂，正丁醇萃取，氨試液洗滌，中性氧化鋁柱凈化等操作，有效地消除了雜質(zhì)成分干擾，使薄層色譜清晰可辨；同時(shí)，在本項(xiàng)試驗(yàn)中，曾嘗試采用藥典色譜條件，即以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)上層溶液為展開(kāi)劑，采用硅膠G薄層板，結(jié)果卻因供試品中川續(xù)斷皂苷VI受其上方一黃色斑點(diǎn)干擾，使得對(duì)照品與供試品色譜行為不甚一致，且存在斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象，通過(guò)采用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)試驗(yàn)，仍無(wú)法解決，經(jīng)摸索以 NaOH溶液制備的硅膠G薄層板展開(kāi)，得到的結(jié)果較好，而以0.5%NaOH溶液制備的硅膠G薄層板得到的色譜為最好。在對(duì)處方中千年健藥材進(jìn)行TLC定性鑒別時(shí)，由于制劑中千年健揮發(fā)油采用倍他環(huán)糊精包合，其中揮發(fā)性成分采用乙醚直接提取效率較低，影響色譜結(jié)果判斷；而通過(guò)揮發(fā)油提取器提取，樣品成分提取效率得到提高，色譜斑點(diǎn)明顯，對(duì)照藥材用乙醚提取則可。

3.2 淫羊藿苷含量測(cè)定條件的確定 關(guān)于淫羊藿中淫羊藿苷的含量測(cè)定及提取文獻(xiàn)報(bào)道[2,8]較多，供試品溶液的制備多選用乙醇或甲醇為提取溶劑，超聲或回流提取，再以聚酰胺處理或以乙酸乙酯萃取，本文優(yōu)選以甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，再用乙酸乙酯萃取，既能保證制劑中的淫羊藿苷被提取完全，也盡可能地減少雜質(zhì)對(duì)淫羊藿苷測(cè)定的干擾。采用《中國(guó)藥典》2015年版(一部)淫羊藿含量測(cè)定項(xiàng)下的乙腈-水(30∶70)為流動(dòng)相，以270 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，即可滿足淫羊藿苷的分離[9]。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，本文所建立的方法能較好地應(yīng)用于顆粒的質(zhì)量控制。