可食牡丹鮮花酶法制汁及主成分HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定

向進(jìn)樂，趙勝娟，馬麗蘋，金文剛，費(fèi)鵬，樊金玲，朱文學(xué)*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽,471023) 2(陜西理工大學(xué) 生工學(xué)院，陜西 漢中,723001) 3(河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽,471023)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)為毛茛科芍藥屬木本植物，有“花中之王”的美譽(yù)，分布于我國大部分地區(qū)，在洛陽、菏澤、彭州等地有大量種植[1]。除作為重要的觀賞植物，牡丹花還有很高的食用價(jià)值[2-3]。研究人員通過大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)[4]和小鼠急性毒性試驗(yàn)[5]證實(shí)了牡丹花的食用安全性?！傍P丹”牡丹花于2013年經(jīng)國家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)，正式成為新食品原料[6]，也是目前唯一被批準(zhǔn)的花朵可食的牡丹品種?？墒衬档せI養(yǎng)素豐富，包括糖分、有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)等，還含有酚酸、沒食子單寧、黃酮、多糖等多種生物活性成分[2,5,7-9]。牡丹花營養(yǎng)和保健食品的開發(fā)是延伸牡丹產(chǎn)業(yè)鏈的重要途經(jīng)之一，已報(bào)道的牡丹花食品包括牡丹花茶、牡丹鮮花餅、牡丹花酸奶、牡丹花營養(yǎng)酒、牡丹花飲料、牡丹花脯等[7,10]。

牡丹花的色系、品種繁多，較常作為藥用，其藥用成分的分析與鑒定的報(bào)道較多，鑒定的主要小分子活性成分有四類：(1)沒食子酸及其衍生物，包括沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酰葡萄糖苷、沒食子單寧等[9,11-13]；(2)黃酮糖苷類，包括槲皮素糖苷、山奈酚糖苷、芹菜素糖苷、異鼠李亭糖苷、金圣草素糖苷等[9,13-16]；(3)花色苷類，包括矢車菊糖苷、天竺葵糖苷、芍藥花青苷等[9,16-17]；(4)單萜糖苷類，包括芍藥苷、乙酰芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、牡丹皮苷等[11-13]。

“鳳丹”牡丹屬于白色系牡丹花，不含花色素[9]，具有食用安全性[6]。閆慧嬌等[18]分離鑒定了“鳳丹”花瓣中的1個(gè)黃酮類化合物(kaempferol-3,7-di-O-β-D-glucopyranoside)， 2個(gè)沒食子酸鞣質(zhì)，分別為1-O-galloyl-β-D-glucose和1,2,3,4,6-trigalloyl-β-D-glucose。付磊[19]也報(bào)道了“鳳丹”牡丹花的總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性。但目前對(duì)可食用的“鳳丹”牡丹花及其鮮花汁中的主要有機(jī)酸、多酚物質(zhì)以及萜類等成分的系統(tǒng)鑒定的研究報(bào)道較少。

本研究以“鳳丹”牡丹鮮花為原料，通過酶法提高牡丹鮮花出汁率，可為牡丹花液態(tài)食品開發(fā)提供生產(chǎn)基料。采用高效液相色譜與四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS-MS)聯(lián)用技術(shù)分析可食牡丹鮮花汁中主要化學(xué)物質(zhì)，以期為可食牡丹花保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“鳳丹”牡丹鮮花：采摘于河南科技大學(xué)牡丹園；果膠酶(20 U/mg)、纖維素酶(30 U/mg)、木瓜蛋白酶(50 U/mg)：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；Folin-Ciocalteu試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；沒食子酸、沒食子酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸、色譜甲醇：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-26恒溫水浴鍋、恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；打漿機(jī)，九陽衛(wèi)廚有限公司；UV-2350 型紫外分光光度計(jì)，上海優(yōu)尼科； Waters 2695高效液相色譜儀(連接有二元泵、微型真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器717 plus、柱溫箱、PDA檢測(cè)器、Q-TOF -MS質(zhì)譜檢測(cè)器)，美國Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牡丹鮮花制汁工藝

工藝流程：

牡丹鮮花→清洗→蒸汽處理→加水破碎→酶解處理→榨汁→牡丹鮮花汁→離心→分析測(cè)定

技術(shù)要點(diǎn)：

牡丹鮮花清洗、瀝干、蒸汽殺青處理1 min，冷卻備用；殺青后的牡丹花按原料∶水=1∶4(質(zhì)量比)，加入純水破碎打漿；牡丹花漿加入酶制劑進(jìn)行處理，然后壓榨取汁。

1.3.2 牡丹鮮花漿酶解工藝

(1)酶制劑的篩選：按牡丹鮮花漿液質(zhì)量分別加入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶，在40 ℃水浴酶解120 min后壓榨取汁，以空白(未進(jìn)行酶水解)為對(duì)照，計(jì)算牡丹鮮花出汁率、測(cè)定牡丹鮮花汁總酚含量。

(2)酶制劑的配比：果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶按照1∶1∶1，1∶2∶1，1∶3∶1,2∶2∶1的質(zhì)量比形成復(fù)合酶制劑，按總酶用量0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))加入牡丹花漿液，在40 ℃水浴酶解120 min，壓榨取汁，計(jì)算出汁率。

(3)酶解溫度：加入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的復(fù)合酶制劑，分別在30、40、50、60 ℃水浴酶解120 min，壓榨取汁。

(4)復(fù)合酶制劑的加入量：將優(yōu)化后的組合酶制劑分別加入不同量0.1%，0.15%，0.2%，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的復(fù)合酶制劑，50 ℃水浴酶解120 min，壓榨取汁。

(5)酶解時(shí)間：添加0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的復(fù)合酶制劑，50 ℃水浴酶解30，60，90，120 min，壓榨取汁，計(jì)算出汁率。

1.3.3 出汁率的計(jì)算

牡丹鮮花出汁率的計(jì)算參考向進(jìn)樂等[20]的方法，按照公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.4 總酚含量測(cè)定

牡丹鮮花汁總酚采用Folin-Ciocalteu比色法[21]測(cè)定，以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.232 9x- 0.007 2(R2=0.996 3)?？偡雍恳詻]食子酸計(jì)(mg/L)。

1.3.5 HPLC色譜條件

Gemini 5μm C18110A色譜柱(150 mm×4.6 mm Phenomenex，美國)。柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.9 mL/min，分析時(shí)間70 min，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)在210～600 nm掃描。二元梯度洗脫液：流動(dòng)相A(0.1%的甲酸水溶液)，流動(dòng)相B(含0.1%甲酸的色譜甲醇)，洗脫程序如表1所示。

表1 二元梯度洗脫程序[22]Table 1 Binary gradient elution program

1.3.6 質(zhì)譜條件[22]

飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF-MS)采用負(fù)離子模式(ESI-)，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍100～1 500m/z，分辨率5 000。全質(zhì)譜掃描條件：毛細(xì)管電壓1.45 kV，錐孔電壓30 V；錐孔氣體(He)和去溶劑化氣體(N2)流速分別設(shè)定為45 L/h，900 L/h。離子化溫度120 ℃，去溶劑化溫度250 ℃。二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量設(shè)定為20，30，45 V，獲取MS/MS圖。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹鮮花酶處理制汁工藝優(yōu)化

2.1.1 酶制劑的選擇

酶處理能顯著提高果蔬汁、茶汁等液態(tài)食品的出汁率、澄清度、營養(yǎng)和功能成分以及香氣，在液態(tài)食品加工中有非常廣泛的用途[23-25]。常用的酶制劑主要是果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、單寧酶以及β-葡萄糖苷酶等[23,26]。牡丹鮮花殺青后打漿，分別添加0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶，40 ℃酶解120 min，壓榨取汁。計(jì)算出汁率，測(cè)定牡丹鮮花汁總酚含量。不同酶制劑對(duì)牡丹花出汁率和總酚含量的影響結(jié)果如表2所示。

表2 不同酶制劑對(duì)牡丹花出汁率和總酚含量的影響Table 2 Effects of different enzymes treatment onyield and total phenol content of peony juice

注：a,b,c不同字母表示差異顯著性(P<0.05)。下同。

由表2可以看出，3種酶制劑均能顯著提高牡丹鮮花出汁率，而總酚濃度差異變化不顯著。由于牡丹鮮花汁液產(chǎn)量顯著增加，說明酶處理能提高牡丹花酚類物質(zhì)的得率。纖維素酶處理后牡丹鮮花出汁率最高。

2.1.2 酶制劑的復(fù)配

復(fù)合酶制劑的應(yīng)用往往能起到協(xié)同效果，提高出汁率和產(chǎn)品質(zhì)量[23,25,27]。本研究從提高出汁率、減少沉淀、提高牡丹花鮮汁的穩(wěn)定性，并一定程度上改善牡丹花鮮汁的風(fēng)味品質(zhì)等方面，研究了纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶復(fù)配制劑處理對(duì)牡丹花漿的影響。由表2可知，纖維素酶有更好的效果，故在復(fù)合酶配比時(shí)適當(dāng)增大纖維素酶的比例，加酶質(zhì)量為漿液質(zhì)量的0.1%。

復(fù)合酶制劑不同配比對(duì)出汁率的影響如圖1所示?？梢钥闯?，果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶(質(zhì)量比)為1∶2∶1和2∶2∶1出汁率較高。果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2∶1(質(zhì)量比)處理后，相比于未經(jīng)酶處理，牡丹鮮花出汁率能提高約20%。故本研究中以該復(fù)配比作為復(fù)合酶使用。

圖1 復(fù)合酶制劑不同配比對(duì)牡丹花出汁率的影響Fig.1 Effects of formulations of compound enzyme treatment on yield of peony juice注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

2.1.3 復(fù)合酶處理溫度

酶處理溫度對(duì)酶制劑的催化活力有顯著影響，不同酶制劑以及復(fù)合酶制劑的最佳催化能力不同[27]。以2.1.2中優(yōu)化的果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2∶1 的復(fù)合酶制劑處理牡丹鮮花漿，不同溫度條件復(fù)合酶處理對(duì)出汁率的影響如圖2?？梢钥闯?，30～60 ℃，相比30 ℃，較高的酶解溫度能顯著提高牡丹鮮花出汁率。酶解溫度在50 ℃時(shí)出汁率最高，其次是40 ℃，兩者無顯著差異。

圖2 復(fù)合酶處理溫度對(duì)牡丹花出汁率的影響Fig.2 Effects of temperature of compound enzyme treatment on yield of peony juice

2.1.4 復(fù)合酶的添加量

復(fù)合酶添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))從0.10%提高0.25%，隨著酶制劑使用量的增加，牡丹花出汁率顯著升高，結(jié)果如圖3，當(dāng)加酶量超過0.15%后出汁率升高不明顯?？紤]到加工成本，選擇添加復(fù)合酶制劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%。

圖3 復(fù)合酶制劑添加量對(duì)牡丹花出汁率的影響Fig.3 Effects of amount of compound enzyme on yield of peony juice

2.1.5 復(fù)合酶處理時(shí)間

復(fù)合酶處理時(shí)間對(duì)牡丹花出汁率的影響如圖4所示。隨著酶制劑酶解時(shí)間延長，牡丹花出汁率逐漸升高，具有顯著差異。但酶解時(shí)間超過90 min，延長時(shí)間出汁率提高效果不顯著?？紤]到生產(chǎn)效率，酶解時(shí)間宜選用90 min。經(jīng)過復(fù)合酶處理90 min，牡丹鮮花出汁率提高22.3%。

圖4 復(fù)合酶處理時(shí)間對(duì)牡丹花出汁率的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on yield of peony juice

2.2 牡丹鮮花汁主要成分的HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定

牡丹花富含多酚、單萜糖苷等功效物質(zhì)。牡丹鮮花汁液化學(xué)組分經(jīng)高效液相色譜分離、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)掃描，總離子流圖(TIC)和基峰圖(BPC)如圖5所示。飛行時(shí)間質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下(TOF-MS-ESI-)掃描結(jié)果如圖6所示。根據(jù)各個(gè)組分二級(jí)質(zhì)譜碎片信息以及DAD光譜圖，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及文獻(xiàn)報(bào)道，鑒定了20個(gè)主要色譜峰，包括有機(jī)酸、酚酸、黃酮和單帖糖苷，鑒定結(jié)果如表3所示。

2.2.1 有機(jī)酸

成分1的保留時(shí)間最短，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z175，DAD顯示在265 nm處有最大吸收，結(jié)合參考文獻(xiàn)[28]，鑒定該成分為抗壞血酸。抗壞血酸是牡丹花中的重要水溶性維生素之一[3]，說明牡丹鮮花榨汁后Vc得到保留。成分2一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z133，二級(jí)質(zhì)譜碎片m/z115[M-H-H2O]-；成分3的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z191，二級(jí)質(zhì)譜碎片m/z115[M-H-CO2-2×H2O]-，結(jié)合參考文獻(xiàn)[29]可以判斷成分2和3分別為蘋果酸和檸檬酸?？梢钥闯瞿档r花汁主要有機(jī)酸為Vc、蘋果酸和檸檬酸。

表3 牡丹鮮花汁主要化學(xué)成分的質(zhì)譜信息和鑒定結(jié)果Table 3 MS/MS information and identified phytochemical compounds in peony juice

注：a通過標(biāo)準(zhǔn)品鑒定，其他成分通過與文獻(xiàn)比較質(zhì)譜和光譜信息判定。

A-總離子流圖；B-基峰圖圖5 牡丹鮮花汁化學(xué)組分的總離子流(TIC)和基峰(BP)圖Fig.5 Total ion chromatography and base peak chromatography of phytochemicals in peony juice

圖6 牡丹鮮花汁化學(xué)組分TOF-MS-ESI-圖Fig.6 TOF-MS-ESI- chromatography of phytochemicals in peony juice

2.2.2 沒食子酸衍生物

成分5的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z169，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜信息與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，鑒定為沒食子酸。成分4的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z331；二級(jí)質(zhì)譜主要碎片為[M-H]-m/z169，是母離子丟失一個(gè)己糖基(162 Da)，其紫外光譜特征與成分5基本相同，成分4鑒定為沒食子酰葡萄糖[13]。成分6一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z183，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片[M-H]-m/z168、m/z124，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，鑒定為沒食子酸甲酯。成分10的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z335；二級(jí)質(zhì)譜主要碎片[M-H]-m/z183，是母離子丟失一個(gè)沒食子?；?152 Da)；其紫外光譜特征與沒食子酸甲酯基本相同，成分10鑒定為沒食子酰沒食子酸甲酯。

成分11一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z為939，二級(jí)質(zhì)譜碎片[M-H]-m/z787、m/z769分別為母離子丟失m/z152 Da、m/z170 Da，其他碎片信息顯示該成分為含多個(gè)沒食子?；幕衔铮渥贤夤庾V特征也與沒食子酸基本相同；根據(jù)文獻(xiàn)[30]，成分11鑒定為5-O-沒食子酰葡萄糖。成分12～14的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z均為1 091，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片[M-H]-m/z939，是母離子丟失m/z152 Da的結(jié)果，其他子離子碎片信息與成分11一致，根據(jù)文獻(xiàn)[30-31]，成分 12～14鑒定為6-O-沒食子酰葡萄糖異構(gòu)體。從BP圖(圖5)可以看出，沒食子單寧為牡丹鮮花汁中含量較為豐富的多酚物質(zhì)。

2.2.3 黃酮糖苷

成分7一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z449，二級(jí)質(zhì)譜碎片[M-H]-m/z287為母離子丟失1個(gè)已糖基m/z162 Da的結(jié)果。結(jié)合其紫外光譜特征，可以判斷成分7為黃酮糖苷。根據(jù)參考文獻(xiàn)[32]，成分7鑒定為圣草酚葡萄糖苷。成分9一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z609，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片[M-H]-m/z447、m/z285為母離子連續(xù)丟失2個(gè)已糖基m/z162 Da的結(jié)果。DAD掃描顯示典型的黃酮紫外光譜特征，鑒定成分7為山奈酚-3, 7-O-二葡萄糖苷[13]。成分15、16、19同樣具有黃酮類化合物典型的紫外光譜特征。根據(jù)質(zhì)譜信息比對(duì)文獻(xiàn)[13,15]，成分15、16、19分別鑒定為木犀草素-7-O-葡萄糖苷，山奈酚-3-O-沒食子酰葡萄糖苷，山奈酚-3-O-葡萄糖苷。成分17的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z431，二級(jí)質(zhì)譜碎片[M-H]-m/z268、m/z269為母離子丟失1個(gè)已糖基m/z162 Da的結(jié)果，成分17鑒定為芹菜素-7-O-葡萄糖苷[13]。成分18的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z577，二級(jí)質(zhì)譜碎片[M-H]-m/z269為母離子丟失1個(gè)脫氧己糖-己糖基m/z308 Da的結(jié)果，成分18鑒定為芹菜素-7-O-新橘皮糖苷[15]。黃酮糖苷為牡丹花主要活性成分[9,15]，牡丹鮮花汁中黃酮成分以山奈酚和芹菜素的糖苷化合物為主。

2.2.4 單帖糖苷

成分8和20的一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z479、m/z629，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片與文獻(xiàn)[13]報(bào)道結(jié)果一致，鑒定為芍藥苷和牡丹皮苷B。成分21色譜峰響應(yīng)值也較高，可能為牡丹花中極性較弱的化合物，一級(jí)質(zhì)譜[M-H]-m/z493，但本研究未能鑒定。

3 結(jié)論

可食“鳳丹”牡丹鮮花經(jīng)蒸汽殺青、打漿后，添加果膠酶、纖維素酶、蛋白酶法處理可以提高牡丹鮮花出汁率。由果膠酶∶纖維素酶∶木瓜蛋白酶以質(zhì)量比1∶2∶1組成的復(fù)合酶制劑能顯著提高牡丹鮮花出汁率，復(fù)合酶處理?xiàng)l件為：酶添加量0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間90 min。復(fù)合酶法制備的牡丹鮮花汁可以作為牡丹花液態(tài)食品生產(chǎn)基料。

高效液相色譜與四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS-MS)聯(lián)用技術(shù)可用于定性分析牡丹鮮花汁中主要生物活性物質(zhì)，鑒定了牡丹鮮花汁中的20個(gè)主要成分，其中3個(gè)有機(jī)酸、8個(gè)酚酸、7個(gè)黃酮、1個(gè)芍藥苷以及1個(gè)牡丹皮苷。酚酸和黃酮苷是牡丹鮮花汁中主要活性成分，主要包括沒食子酸、沒食子酰葡萄糖、5-O-沒食子酰單寧、6-O-沒食子酰單寧、芹菜素7-O-葡萄糖苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷和山奈酚-3,7-O-二葡萄糖苷等。