麥芽品種多重?zé)晒釹SR標(biāo)記指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

張志軍，岳杰，尹花

(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島啤酒股份有限公司，山東 青島，266100)

中國啤酒產(chǎn)量連續(xù)多年位居世界第一，但啤酒大麥長期依賴進(jìn)口，主要來自加拿大、澳大利亞、法國等主要大麥產(chǎn)區(qū)，主流大麥品種已達(dá)20多種。麥芽是大麥經(jīng)浸麥、發(fā)芽、焙焦后制成的，不同品種的麥芽在糖化、過濾、發(fā)酵、風(fēng)味特征等方面存在較大差異。受利益驅(qū)使，某些經(jīng)銷商在高價(jià)麥芽中摻入低價(jià)麥芽，或者通過麥芽混摻將原本指標(biāo)不合格的麥芽調(diào)配成為“優(yōu)質(zhì)麥芽”。麥芽摻假不僅給啤酒企業(yè)采購帶來巨大的直接經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)對(duì)糖化、過濾和發(fā)酵過程帶來間接的影響，最終影響啤酒品質(zhì)的穩(wěn)定性和一致性。因此，啤酒行業(yè)亟需建立一種準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的麥芽品種鑒定技術(shù)，從源頭上保障啤酒原料的純凈性和一致性。

與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別法和田間小區(qū)種植等農(nóng)作物種子真實(shí)性鑒定技術(shù)相比，DNA分子標(biāo)記具有周期短、重復(fù)性好、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，已在農(nóng)作物指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等方面得到了廣泛應(yīng)用[1-3]。作為第二代分子標(biāo)記技術(shù)，簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、擴(kuò)增模式簡單等典型特征[4]。國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(UPOV)在BMT分子測(cè)試指南中，將SSR作為DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的主要方法。目前，SSR廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、水稻等作物的指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性、品種鑒定分析等[5-12]。但國內(nèi)外利用SSR進(jìn)行麥芽品種鑒定方面的研究報(bào)道極少，谷方紅等[13]利用5對(duì)SSR引物對(duì)國內(nèi)外8個(gè)麥芽品種進(jìn)行了區(qū)分，但文中并未給出具體的引物序列信息，品種數(shù)量較少，且使用的聚丙烯酰胺凝膠電泳存在分辨率低、無法準(zhǔn)確讀取擴(kuò)增片段大小等缺點(diǎn)[14]，因此無法進(jìn)行應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)室前期基于TP-M13熒光標(biāo)記結(jié)合單重?zé)晒釶CR技術(shù)可對(duì)23個(gè)麥芽品種進(jìn)行區(qū)分[15]，但由于毛細(xì)管電泳的試劑及引物成本較高，該法在大批量、多批次樣品檢測(cè)時(shí)存在檢測(cè)周期長、成本高等缺點(diǎn)。隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，多重?zé)晒釶CR與毛細(xì)管電泳多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)的結(jié)合剛好可以解決這一難題。多重PCR(mutiplex PCR)是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，針對(duì)一個(gè)或多個(gè)DNA模板擴(kuò)增出多個(gè)目的片段的技術(shù)，更加高效、快捷、低成本。因此，在引物組合的設(shè)計(jì)時(shí)不僅要考慮引物在品種區(qū)分上的互補(bǔ)性、擴(kuò)增穩(wěn)定性，還要具有構(gòu)建多重PCR體系的潛力。毛細(xì)管電泳多重?zé)晒鈾z測(cè)法是采用3對(duì)以上的引物組合構(gòu)建多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系，通過一次毛細(xì)管電泳同時(shí)檢測(cè)3個(gè)以上的SSR位點(diǎn)，具有簡便、可靠、低成本及高通量的優(yōu)點(diǎn)，已在玉米、水稻、棉花等作物的指紋圖譜構(gòu)建及品種鑒定方面得到廣泛的應(yīng)用[16-24]。目前，利用毛細(xì)管電泳多重?zé)晒膺M(jìn)行麥芽品種核心引物篩選、多重PCR體系優(yōu)化、指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的研究尚無報(bào)道。

本研究基于毛細(xì)管電泳多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)，對(duì)前期篩選的引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，根據(jù)多重PCR體系優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行核心引物篩選，并利用核心引物構(gòu)建國內(nèi)外主要麥芽品種的指紋數(shù)據(jù)庫，為麥芽品種和純度鑒定提供一種快速、準(zhǔn)確、低成本的高通量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集24種啤酒大麥不同年份的72份樣品作為試驗(yàn)材料，來源于加拿大、澳大利亞、法國等主要大麥產(chǎn)區(qū)，涵蓋當(dāng)前國際主流大麥品種，樣品分別由加拿大啤酒大麥技術(shù)中心(CMBTC)、澳大利亞農(nóng)作物育種公司(InterGrain)、法國釀造與制麥研究院(IFBM)等機(jī)構(gòu)提供，見表1。

植物DNA提取試劑盒，北京百泰克公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs，美國Sigma-Aldrich公司；GeXP遺傳分析系統(tǒng)試劑，美國Sciex公司；熒光引物，北京英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

96通道高通量核酸提取儀，北京百泰克公司；C1000 TouchTMPCR儀，美國Bio-Rad公司；GenomeLabTMGeXP遺傳分析系統(tǒng)，美國Sciex公司；CK1000D高通量組織研磨儀，北京托摩根公司；5430型離心機(jī)，德國Eppendorf公司； NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

另一些有大理想的人則攻破一堵一堵的墻闖了進(jìn)來，走到這個(gè)院落中心，在不知不覺中就變?yōu)檫@里的一分子，然后用那雙毀墻的手，拾起滿地散落的磚頭，把墻重新壘起來，而且砌得又厚又高。

供試的大麥品種通過實(shí)驗(yàn)室制麥得到相應(yīng)的麥芽樣品，4 ℃保存。取單粒麥芽置于2.0 mL離心管中，加7 mm鋼珠，高通量組織研磨儀1 200 r/min粉碎1 min。采用植物DNA提取試劑盒進(jìn)行麥芽DNA提取，步驟參照說明書。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測(cè)DNA純度和濃度，DNA濃度統(tǒng)一稀釋到20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 大麥品種及來源Table 1 Varieties and sources of barley

注：CWB，加拿大小麥局；CMBTC，加拿大啤酒大麥技術(shù)中心；InterGrain，澳大利亞農(nóng)作物育種公司；IFBM，法國釀造與制麥研究院；紅興隆，黑龍江紅興隆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

1.3.2 引物合成

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期引物篩選的結(jié)果[15,25]，選擇分布于7條染色體的12對(duì)多態(tài)性豐富、具有單峰或雙峰特征的引物進(jìn)行合成，正向引物用Alexa Fluor 647(藍(lán))、Alexa Fluor 680(綠)和Alexa Fluor 750(黑)中的一種熒光進(jìn)行標(biāo)記，引物序列信息見表2。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

多重PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括4 μL 10×PCR Buffer、4 μL 25 mmol/L MgCl2、4 μL 2 mmol/L dNTP、0.7 UTaqDNA聚合酶、0.03～0.06 μmol/L正向引物和反向引物、樣品DNA 20 ng。多重PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.4 毛細(xì)管電泳檢測(cè)

取0.5 μL分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)加入39.5 μL甲酰胺緩沖液，混合均勻，加入樣品板中；取1 μLPCR產(chǎn)物加入上樣板中，加石蠟油覆蓋防止揮發(fā)；緩沖液板中添加3/4體積分離緩沖液。毛細(xì)管電泳進(jìn)樣電壓2.0 kV，時(shí)間30 s，90 ℃變性2 min，分離電壓6.0 kV，分離時(shí)間35 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物分離過程中，GeXP遺傳分析系統(tǒng)利用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行收集、儲(chǔ)存，參照分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)得到圖譜中各片段的大小。通過人工分析將電泳圖譜中的特征峰判讀為對(duì)應(yīng)的等位基因，取3次重復(fù)的平均值并四舍五入取整，作為該品種的等位基因大小。電泳圖譜中的單峰(純合型)用X表示，雙峰(雜合型)的主峰和次峰用X/Y表示。利用Power Marker V3.25軟件分析等位基因數(shù)、計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)，根據(jù)各品種等位基因大小進(jìn)行麥芽品種DNA指紋數(shù)據(jù)分析。

表2 SSR引物序列信息Table 2 Information of SSR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性分析

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期單重PCR擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳圖譜進(jìn)行分析，剔除雜峰、非特異峰等特殊峰形的引物，選擇等位基因數(shù)≥3且具有單峰或雙峰特征的12對(duì)引物作為候選引物。利用12對(duì)基本引物對(duì)24個(gè)麥芽品種進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測(cè)到135個(gè)等位基因，每對(duì)引物3～11個(gè)，平均為5.63個(gè)。引物HVM68多態(tài)性最豐富，在165～299bp包含11個(gè)等位基因；引物scssr07759和scssr10559多態(tài)性最低，僅有3個(gè)等位基因。各引物的多態(tài)性信息含量變化為0.37～0.82，平均為0.68，表明不同麥芽品種間具有豐富的遺傳多樣性。引物多態(tài)性信息，見表3。

表3 SSR引物多態(tài)性分析Table 3 Analysis of SSR primer polymorphism

2.2 引物組合設(shè)計(jì)

本研究初選的12對(duì)多態(tài)性引物可實(shí)現(xiàn)全部24個(gè)麥芽品種的區(qū)分，考慮到快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)要求，對(duì)引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)。基于最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構(gòu)建原則[10]，從12對(duì)候選引物中選擇擴(kuò)增片段大小差異大、多態(tài)性互補(bǔ)的引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，得到4個(gè)引物組，每組引物數(shù)量3～5對(duì)。其中，組合1由3對(duì)引物(HVM68、EBmag0007和Bmac755)構(gòu)成，組合2由4對(duì)引物(Bmag382、Ebmac0415、HVM40和scssr 10148)構(gòu)成，組合3由4對(duì)引物(HVM40、HVM68、scssr 10148和Bmag0007)構(gòu)成，組合4由5對(duì)引物(scssr 07759、scssr10559、BMAG0867、Bmag0120和EBmac 755)構(gòu)成。以組合1為例，3對(duì)引物分別進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增后的指紋圖譜，見圖1。

A-引物Bmac775；B-引物HVM68；C-引物EBmag0007圖1 加麥Copeland在引物組合1的指紋圖譜Fig.1 The fingerprinting of Copeland under combination 1

由圖1可知，利用組合1的3對(duì)引物分別對(duì)Copeland進(jìn)行擴(kuò)增。Bmac755擴(kuò)增后在146 bp處有一個(gè)單峰擴(kuò)增片段(圖1-A)；HVM68為雙峰特征，分別在223 bp和265 bp處各有一個(gè)單峰擴(kuò)增片段(圖1-B)；EBmag0007在253 bp處有單峰擴(kuò)增片段(圖1-C)。引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)時(shí)不僅要考慮引物多態(tài)性、擴(kuò)增穩(wěn)定性，還要兼顧后期構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系的潛力。

2.3 多重PCR體系構(gòu)建

為進(jìn)一步提高檢測(cè)效率，對(duì)4個(gè)引物組分別進(jìn)行多重PCR體系組合試驗(yàn)。在單重PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)上逐漸增加引物，分別進(jìn)行兩重、三重和四重PCR反應(yīng)。引物進(jìn)行熒光標(biāo)記時(shí)，擴(kuò)增片段大小不重合的引物可添加相同熒光標(biāo)記，擴(kuò)增片段大小有重合的引物需用不同熒光標(biāo)記加以區(qū)分。通過優(yōu)化引物濃度、退火溫度等條件，優(yōu)化多重PCR體系，確保多引物在一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增效率相同且彼此不干擾。最后，將多重PCR擴(kuò)增片段與單重PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行比對(duì)，分析片段大小是否一致、有無非特異峰。

結(jié)果表明，組合1、組合2和組合3的多重PCR體系均能成功構(gòu)建，引物組4中存在非特異擴(kuò)增，可能是引物間存在相互作用所致。進(jìn)一步對(duì)3個(gè)引物組的引物數(shù)量、擴(kuò)增效率、組合擴(kuò)展能力等因素進(jìn)行綜合比較，組合1引物數(shù)量最少、擴(kuò)增一致性好，且組合擴(kuò)展能力最好。以組合1為例，引物EBmag0007和Bmac755之間擴(kuò)增片段范圍差異在50 bp以上，都用Alexa Fluor 680(綠)熒光標(biāo)記，3對(duì)引物構(gòu)建的多重PCR反應(yīng)體系用于品種指紋分析，指紋圖譜見圖2。

A-Copelang；B-Gairdner圖2 引物組合1在麥芽品種Copeland和Gairdner下的多重PCR指紋圖譜Fig.2 The multiple PCR fingerprint of combination from varieties of Copeland and Gairdner

圖2為組合1對(duì)Copeland擴(kuò)增后的指紋圖譜(圖2-A)，EBmac755的單峰擴(kuò)增片段大小為146 bp，HVM68的雙峰大小為223/265 bp，Bmag0007的單峰大小為253 bp。Gairdner在組合1擴(kuò)增下的擴(kuò)增片段大小分別為140 bp、223/259 bp和267 bp(圖2-B)，與Copeland的片段大小完全不同。多重PCR擴(kuò)增結(jié)果與3對(duì)引物單獨(dú)擴(kuò)增后的片段大小完全一致，無非特異性峰出現(xiàn)。

2.4 品種指紋數(shù)據(jù)

在選定的24個(gè)麥芽品種中，利用毛細(xì)管電泳收集引物組合1的三重PCR在群體中的特異性擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)不同引物擴(kuò)增片段大小進(jìn)行麥芽品種指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，見表4。

3對(duì)核心引物在24個(gè)麥芽品種中共得到25個(gè)等位基因，每對(duì)引物的等位基因6～11個(gè)不等，平均產(chǎn)生8.3個(gè)等位基因，引物多態(tài)性較好。其中，引物HVM68多態(tài)性最豐富，在165～299 bp包括11個(gè)等位基因，EBmag0007在253～285 bp有8個(gè)等位基因，Bmac755在142～160 bp有6個(gè)等位基因。

表4 24種麥芽在3對(duì)SSR引物下的標(biāo)準(zhǔn)指紋數(shù)據(jù)Table 4 The standard fingerprint data of 24 varieties of malt at 3 pairs SSR primers

注：-表示無。

2.5 品種區(qū)分

將每對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因按照從小到大的順序排列，采用1～9的個(gè)位數(shù)字和26個(gè)英文字母的組合對(duì)指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼[17]。按照HVM68、Bmac755和EBmag0007的順序排列核心引物，引物代碼分別編號(hào)為1、2、3，等位基因按照從小到大的順序分別用a、b、c等英文字母編碼，組合后就構(gòu)成了代表各品種身份所特有的標(biāo)準(zhǔn)指紋代碼，見表5。

按照核心引物固定的排列順序，加麥Copeland的標(biāo)準(zhǔn)指紋代碼為1h2d3a，澳麥Baudin的標(biāo)準(zhǔn)指紋代碼為1a2e3f，品種間差異明顯。某些品種在同一引物下等位基因相同，需要結(jié)合其他引物才能區(qū)分。通過已構(gòu)建的品種指紋代碼，品種區(qū)分不僅簡單明了，還能確定品種等位基因所處的具體位置。特征等位基因是指在一定品種范圍內(nèi)，某一品種區(qū)別與其他所有品種所特有的等位基因[10]。Copeland、Meredith、Sebastian、Planet、Commander、墾16 6個(gè)品種各具有1個(gè)特征引物，Bow和Vlamingh具有2個(gè)特征引物。本研究24個(gè)麥芽品種中8個(gè)品種有11個(gè)特征等位基因，僅用1個(gè)特征引物即可鑒別相應(yīng)的品種。

表5 24種麥芽在3對(duì)核心引物上的標(biāo)準(zhǔn)指紋代碼Table 5 The SSR standard fingerprint coding of 24 varieties of malt at 3 pairs SSR primers

表6 24種麥芽品種區(qū)分的等位基因組合Table 6 The allele-based combination for identification of 24 malt varieties

由表6可知，不同引物彼此組合后在品種區(qū)分效率上差異較大。2對(duì)引物的組合中，HVM68與EBmag0007組合后可區(qū)分13個(gè)品種，區(qū)分率54.2%；HVM68與Bmac755組合后可區(qū)分19個(gè)品種，區(qū)分率79.2%，說明不同引物的組合之間鑒定效率差異較大?，F(xiàn)有引物的等位基因組合中，5種麥芽Metcalfe、Kendall、Latrobe、Compass和Prestige的等位基因相似度較高，需要3對(duì)引物才能完全區(qū)分，區(qū)分難度相對(duì)較大。

3 討論

多年來，麥芽品種混摻已成為麥芽和啤酒行業(yè)內(nèi)的潛規(guī)則，給啤酒企業(yè)的麥芽采購和啤酒生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。由于摻假麥芽與純度合格的優(yōu)質(zhì)麥芽的市場(chǎng)價(jià)格相同，摻假麥芽的獲利空間大，那些誠實(shí)、合規(guī)的企業(yè)獲利空間越來越小，導(dǎo)致劣幣驅(qū)逐良幣。只有建立一種快速、準(zhǔn)確、低成本的麥芽鑒定方法，才能從根本上解決麥芽摻假的行業(yè)困局，促進(jìn)啤酒和麥芽行業(yè)更加健康有序的發(fā)展。

基于最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構(gòu)建原則[10]，但引物篩選工作量大且繁瑣，大部分引物表現(xiàn)存在著缺陷，影響引物的實(shí)用性，能篩選出一對(duì)綜合表現(xiàn)良好、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物較不易[7]。如馮飛等[26]利用19對(duì)條帶清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的SSR引物構(gòu)建了122份向日葵材料的SSR指紋圖譜，董志剛等[27]利用15對(duì)SSR標(biāo)記建立16份葡萄種質(zhì)的分子指紋圖譜，包溫泉等[28]利用9對(duì)SSR引物可實(shí)現(xiàn)16個(gè)仁用杏品種的DNA指紋圖譜。本研究對(duì)初選的12對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，得到4個(gè)引物組也能實(shí)現(xiàn)24個(gè)麥芽品種的區(qū)分，每組引物數(shù)量僅3～5對(duì)。

在毛細(xì)管電泳多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)應(yīng)用方面，DANIEL等[29]利用10對(duì)SSR引物構(gòu)建的兩個(gè)五重PCR擴(kuò)增體系，對(duì)31個(gè)加拿大種植的啤酒大麥品種進(jìn)行區(qū)分；夏春蘭等[16]認(rèn)為，與普通熒光檢測(cè)技術(shù)相比多重PCR熒光檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)效率提高了5.5倍，與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比效率提高了11倍。本研究基于3對(duì)核心引物構(gòu)建的多重?zé)晒釶CR體系，與單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增相比檢測(cè)效率提高了3倍，電泳檢測(cè)成本降低75%，結(jié)果與上述研究基本一致。

隨著品種數(shù)量的進(jìn)一步增加，核心引物組合的區(qū)分能力可能會(huì)逐漸減低，某些品種的指紋圖譜可能完全相同，無法區(qū)分?？紤]到實(shí)際檢測(cè)中樣品數(shù)量大、品種親緣關(guān)系相近的問題，權(quán)衡準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)等要求，可采取“核心引物+擴(kuò)展引物”的組合模式[30]。在進(jìn)行麥芽純度鑒定時(shí)，首先選用3對(duì)核心引物進(jìn)行區(qū)分，其他9對(duì)引物可作為擴(kuò)展引物，核心引物無法區(qū)分時(shí)再啟用擴(kuò)展引物。此外，現(xiàn)有的三重PCR體系中僅用到綠色和黑色2種熒光，藍(lán)色熒光標(biāo)記尚未使用，如有新引物可用藍(lán)色熒光標(biāo)記，為今后進(jìn)行四重、五重PCR研究、擴(kuò)展品種鑒定能力提供了可能。

4 結(jié)論

本研究對(duì)前期篩選的12對(duì)引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，并進(jìn)行多重PCR體系優(yōu)化，將3對(duì)引物(HVM68、EBmag 0007和Bmac755)確定為核心引物，并對(duì)24個(gè)麥芽品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)不同麥芽品種的快速區(qū)分。與單重PCR需要進(jìn)行多次毛細(xì)管電泳分析相比，多重PCR僅需一次毛細(xì)管電泳即可實(shí)現(xiàn)全部麥芽品種的同步鑒定，電泳檢測(cè)時(shí)間和成本顯著降低，為啤酒企業(yè)的大麥、麥芽質(zhì)量監(jiān)控提供有效的檢測(cè)技術(shù)。