塔羅科血橙采后花色苷合成規(guī)律、揮發(fā)性物質(zhì)組分及含量變化分析

馮桂蓉，王小容，謝姣，鄧麗莉,3，明建,3，曾凱芳,3，姚世響,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(國家級食品科學(xué)與工程實(shí)驗教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715)3(西南大學(xué)，食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

血橙屬甜橙類，也是柑橘中唯一能以花色苷著色的種類，果肉呈紅色血絲或血斑狀[1]。塔羅科血橙(Tarocco)最早由意大利引入，是中國血橙的主要品種[2]，在重慶、湖北、湖南等地均有栽種。血橙果肉色澤獨(dú)特，玫瑰香氣濃郁，甜度高，品質(zhì)優(yōu)良。血橙富含β-胡蘿卜素、花色苷、Vc及類黃酮等多酚類，大量礦質(zhì)元素鉀、鈣、鎂，微量礦質(zhì)元素鐵、銅、鋅、錳、鎳等?；ㄉ站哂卸喾N生理活性，包括抗氧化活性、降血壓、抗癌和增強(qiáng)免疫力等[3-4]?；ㄉ沼苫ㄇ嗨睾吞酋セ桑腔ㄇ嗨厣頎顟B(tài)下的存在形式。采前果實(shí)成熟度和光照、土壤及氣候等環(huán)境因素[5]，采后溫度及貯藏時間都與花色苷合成密切相關(guān)。采后低溫貯藏對血橙花色苷合成有明顯的誘導(dǎo)效果，含量可提高10倍以上[6-7]。

花色苷合成通過苯丙烷代謝途徑，即以苯丙氨酸為合成前體，經(jīng)一系列酶催化合成花色苷。關(guān)鍵酶主要有苯丙氨酸裂解酶(phenylalaninammo-nialyase，PAL)、查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)、二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase，DFR)及尿苷二磷酸葡萄糖-類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose3-O-flavonoid glucosyltransferase，UFGT)等[8]。柑橘的香氣成分主要有萜烯類、醇類、酯類、醛類和酮類化合物，其中萜烯類所占比例最大[9]。萜烯類物質(zhì)可由甲羥戊酸(mevalonate pathway，MVA)和2-C-甲基-D赤蘚糖醇-4-磷酸(methyl-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)兩條途徑合成，底物是丙酮酸和3-磷酸甘油醛[10-11]。血橙的食用口感上似乎血絲較多的果實(shí)香氣更為濃郁，但從生物合成途徑來看，花色苷和揮發(fā)性化合物合成的前體都是糖酵解產(chǎn)物，兩種物質(zhì)合成過程是否呈現(xiàn)此消彼長的競爭關(guān)系值得探索。本研究以塔羅科血橙為材料，用固相微萃取法(solid phase micro extraction,SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析揮發(fā)性物質(zhì)組分及含量在無血和有血果實(shí)中的差異，為采后血橙品質(zhì)保持提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塔羅科血橙于2018年1月采于重慶江津果園。挑選大小、形狀、果皮顏色相近、表面無傷的果實(shí)，使用保鮮劑(2，4-二氯苯氧乙酸)稀釋后浸泡30 s，晾干后用PE塑料薄膜袋包裝，置于低溫通風(fēng)庫保藏(8～10 ℃，80%～85%RH)。正己烷(色譜純)，天津四友；色譜純癸酸乙酯(純度≥95%)，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1型手持?jǐn)?shù)顯糖度計，日本Atago公司；20 mL頂空樣品瓶，杭州微米派科技公司；QP2010PLUS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；DB-5MS氣相色譜柱，安捷倫公司；DVB/CAR/PDMS 50/30 μm固相微萃取頭，美國Supelco公司；VIS-722型可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 觀察血橙血絲形成過程及可溶性固形物含量測定

每周選取20個果實(shí)對血橙的血絲形成狀態(tài)進(jìn)行剖面觀察。

可溶性固形物(total soluble solids,TSS)測定：將果實(shí)縱切分為4等份，對每一等份橫切5等分，對果蒂、赤道部位和果頂?shù)墓庥檬殖謹(jǐn)?shù)顯糖度計測定，每部分3次重復(fù)，實(shí)驗進(jìn)行5個生物學(xué)重復(fù)(果實(shí))，每周測定1次。

1.3.2 總花色苷含量測定

參照喻最新[12]實(shí)驗方法測定血橙花色苷含量。將果肉用榨汁機(jī)混勻、過濾、然后離心10 min(10 000 r/min)。取2 mL上清液和8 mL緩沖液A(0.05 mol/L KCl、0.15 mol/L HCl，pH 1.0)混合，取2 mL上清液與8 mL緩沖液B(0.4 mol/L CH3COONa、0.24 mol/L HCl，pH 4.5)混合，分別在510和700 nm處測定吸光值，3個生物學(xué)重復(fù)?；ㄉ蘸坑嬎闳绻?1)所示：

(1)

式中：ε=24 825，表示矢車菊素-3-葡萄糖苷在pH 1.0緩沖液中510 nm下的摩爾吸光系數(shù)；MW=484.82，表示矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量；DF=5，表示本次的稀釋倍數(shù)；L=1，表示本次的光程，cm。

1.3.3 感官評價設(shè)計

參照曹琦[13]方法進(jìn)行感官實(shí)驗。選擇培養(yǎng)12名感官評價員，對有血和無血兩種果肉的6種感官特性進(jìn)行評價，包括橘子香氣、果肉飽滿度、甜味、酸味、橘子風(fēng)味、喜愛度。每種樣品重復(fù)3次，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

續(xù)表1

序號果實(shí)性質(zhì)性質(zhì)描述評分標(biāo)準(zhǔn)/分3甜味有明顯甜味,令人愉悅甜味稍淡感知不到甜味7～94～61～34酸味有明顯的酸味酸味較淡,但能感知到感知不到酸味7～94～61～35橘子風(fēng)味入口后橘子味道濃郁入口后橘子味道不是特別濃郁,且有其他味道入口后橘子味道寡淡,幾乎無味7～94～61～36喜愛度酸甜合適,無其他不良味道稍微偏酸或者甜酸味道較為寡淡非常酸或幾乎沒有甜酸味,甚至有異味7～94～61～3

1.3.4 GC-MS分析

挑選表面飽滿無傷果實(shí)，分別選取有血與無血果肉，使用榨汁機(jī)破碎并混勻。準(zhǔn)確稱量3.0 g果肉勻漿樣品置于頂空樣品瓶中。用50 mL正己烷稀釋10 μL葵酸乙酯(內(nèi)標(biāo))后，取10 μL加入已加樣品的萃取瓶中，立即密封瓶口，用萃取頭在40 ℃恒溫水浴萃取40 min。

GC-MS條件：色譜柱為DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm ID，0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至50 ℃，保持1 min，再2 ℃/min升至70 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；載氣(He)流速4.6 mL/min；壓力33.8 kPa；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣。離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；掃描范圍m/z30～400。

定性及半定量分析：血橙果肉的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)過GC-MS分析鑒定后，以圖譜庫NIST 08和NIST 08S為標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫，檢索結(jié)果與之對照。采用內(nèi)標(biāo)法做定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)使用Origin 8.0，Excel 2010，GraphPad Prism 5繪制相關(guān)圖表，統(tǒng)計學(xué)判斷方法使用t檢驗及單因素方差分析(P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血橙血絲形成規(guī)律

剛采摘的血橙幾乎沒有血絲，隨著貯藏期的延長血絲逐漸形成，最終布滿整個果實(shí)(圖1)。大多數(shù)果實(shí)經(jīng)2周貯藏后仍處于無血狀態(tài)(圖1-A)；果實(shí)貯藏至第4周，果頂部位逐漸出現(xiàn)少量血絲(圖1-B)。第5周(圖1-C)和第6周(圖1-D)血橙處于快速上血階段，紅色呈絲狀還沒有形成斑塊，主要分布在果頂部位較多，且靠近果皮、心部位。第7周血絲逐漸延伸到赤道，并呈血斑狀態(tài)(圖1-E)，隨著貯藏期的延長血斑愈發(fā)明顯。而貯藏后期，血絲逐步在果蒂部位形成貯藏，第16周大部分血橙果肉呈完全著色狀態(tài)(圖1-F)。有研究表明，花色苷含量可能在采后低溫冷藏下急劇增加[14]，塔羅科血橙在8 ℃下貯藏85 d，花色苷含量達(dá)到高峰[15]。從本研究結(jié)果推測，花色苷在低溫貯藏下快速積累、含量增加，與前人報道相似。

圖1 塔羅科血橙采后花色苷積累過程Fig.1 Postharvest accumulation of anthocyanins in Tarocoo orange fruits注：A為第2周；B為第4周；C為第5周；D為第6周；E為第7周；F為第16周。

2.2 血橙可溶性固形物分布規(guī)律

如圖2所示，整個貯藏期的果實(shí)TSS含量始終呈現(xiàn)出果蒂(上)<赤道(中)<果頂(下)的規(guī)律。在1～5周，果實(shí)的TSS含量逐漸增加。在第5～6周時含量顯著上升，并在第6周達(dá)到了最大值：上部為11.2%，中部為12.0%，下部為13.3%，此時果蒂與赤道差異最小。在第7周含量發(fā)生陡降，第8周后同一部位含量差異不大，整體含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。果實(shí)在采后貯藏中要進(jìn)行正常呼吸作用，需要依靠對糖的消耗分解，故而呈現(xiàn)出TSS含量采后初期少量增加而后整體下降趨勢[16]。

圖2 塔羅科血橙貯藏過程中TSS含量變化Fig.2 Distribution pattern of TSS in Tarocoo orange fruits during postharvest storage

2.3 總花色苷含量測定及果實(shí)感官評價

如圖3所示，花色苷是花青素經(jīng)酶催化，與糖結(jié)合而成的甙類物質(zhì)，與血橙顏色密切相關(guān)，是評價果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。測定結(jié)果顯示，花色苷含量顯著影響血橙果肉顏色。有血血橙果肉花色苷含量為(90.26±5.23)mg/mL，無血血橙果肉為(5.14±0.12)mg/mL。有血血橙花色苷含量是無血果肉的17.5倍，差異極顯著(P<0.01)。有研究發(fā)現(xiàn)，塔羅科血橙在低溫貯藏70 d后，果汁的花色苷含量從7.11 mg/mL上升至54.44 mg/mL[17]，變化顯著。在本次實(shí)驗中選取含有明顯血斑的果肉部分，故而花色苷含量更為豐富。

圖3 兩種塔羅科血橙的花色苷總含量Fig.3 Total anthocyanins contents of two types of Tarocoo orange fruits during postharvest storage

如圖4所示，有血血橙的各項感官評分均比無血血橙高，其中兩者汁胞飽滿度均達(dá)到了7.5 分，說明果肉新鮮，符合感官評價的設(shè)計原則。而兩種果肉的酸味均在4.8 分左右，沒有明顯差異。有血與無血血橙的橘子香氣分別為(5.00±0.75)分、(6.58±0.66)分，兩者的橘子香氣差異具備統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。無血血橙的橘子風(fēng)味為(5.67±0.49)分，有血為(7.17±0.93)分，呈極顯著性差異(P<0.01)。甜味性質(zhì)兩者間呈極顯著差異(P<0.01)，有血比無血血橙平均評分高近2分。由感官評價結(jié)果得出，隨著血橙花色苷合成，較之無血果肉其感官性質(zhì)如香氣、風(fēng)味、甜味都有一定程度的提高，在喜愛度的評分中也存在極顯著性差異，一定程度上說明花色苷的積累提高了血橙感官品質(zhì)。

圖4 兩種塔羅科血橙果實(shí)的感官評價Fig.4 Sensory analysis of two types of Tarocoo orange fruits注：*表示兩者具有顯著性差異，P<0.05;**表示極顯著性差異，P<0.01。

2.4 花色苷合成對揮發(fā)性物質(zhì)組分及含量的影響

萜烯類、醛、醇、酯和酮類等化合物是柑橘的主要香氣成分，萜烯類所占比重最大。以單萜、倍半萜及衍生物為主，萜烯類如D-檸檬烯，α-蒎烯、α-異松油烯、香葉烯,其衍生物如芳樟醇、4-松油醇等[18-19]。其中萜烯類如月桂烯、(E)-羅勒烯、β-古巴烯、其衍生物如紫蘇醇、紫蘇醛、反式芳樟醇氧化物、順式芳樟醇氧化物被認(rèn)為是甜橙的特征香氣成分[20]。但目前對于有血與無血血橙揮發(fā)性成分的測定并未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)報道。本實(shí)驗鑒定出無血血橙中含有12種揮發(fā)性成分，有血血橙含有13種，單萜和倍半萜化合物均占據(jù)了主要地位。兩者間的種類差異不大，幾乎都是共有的。其香氣成分主要有D-檸檬烯，β-月桂烯、β-水芹烯、氧化石竹烯等，其他揮發(fā)性物質(zhì)含量較少。在無血與有血兩種狀態(tài)下，果肉揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖見圖5，揮發(fā)性物質(zhì)組分及相對含量見表2。

A-有血血橙；B-無血血橙圖5 塔羅科血橙果肉揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of volatiles of Tarocoo orange flesh

表2 兩種血橙果肉的揮發(fā)性物質(zhì)組分比較Table 2 Comparison of volatile constituents between two types of Tarocoo orange flesh

注：字母相同表示兩者無顯著性差異，不同表示有顯著性差異。

在本次實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，花色苷合成對血橙揮發(fā)性物質(zhì)有一定改變作用。就組分而言，花色苷合成前后果實(shí)所含的單萜和倍半萜類組分差異不大，但含量具有差異。萜烯類化合物中豐度最高的是單萜D-檸檬烯，在花色苷合成后含量顯著增加(P<0.05)。另隨著花色苷合成，含量上升的有Elixene、α-芹子烯、β-倍半水芹烯、葎草烯、β-芹子烯、β-律草烯、α-人參烯、氧化石竹烯，且差異顯著(P<0.05)。β-月桂烯在無血果肉中更多，但差異并無顯著性；兩者間的香葉基丙酮的比值達(dá)到了262.5%，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。ARENA等[21]探究得出塔羅科血橙的香氣成分主要為檸檬烯、α-蒎烯、β-月桂烯及丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸甲酯、己醛等，與摩羅血橙、華盛頓臍橙、瓦倫西亞晚橙相比，塔羅科血橙以α-蒎烯、β-月桂烯及己醛、辛酸乙酯等為特征香氣成分。喬宇等[22]并未檢測到丁酸甲酯，而檢測到了芳樟醇。在此次實(shí)驗中，辛酸乙酯僅出現(xiàn)在有血果肉中，芳樟醇則特異性地存在于無血果肉中，推測花色苷合成與揮發(fā)性物質(zhì)變化具有一定聯(lián)系。但揮發(fā)性物質(zhì)的這種差異也有可能是因為血橙品種不同，栽培條件、生長因素及后續(xù)的貯藏過程及樣品的處理檢測方法，檢驗設(shè)備并不完全相同所致。

3 結(jié)論與討論

部分柑橘種類中果實(shí)可溶性固形物呈現(xiàn)梯度分布[23-24]，最近發(fā)現(xiàn)這種梯度分布可能是柑橘果實(shí)的普遍現(xiàn)象[25]，可溶性固形物濃度從果蒂至果頂方向逐漸升高[26]。本研究首次發(fā)現(xiàn)血橙可溶性固形物也呈類似的梯度分布。可溶性固形物含量在貯藏第6周達(dá)到頂峰，花色苷也在第6周快速合成，具有較強(qiáng)的相關(guān)性；可溶性固形物含量最高的部位是果頂處，同時也是花色苷合成的起始部位。前人研究顯示糖是誘導(dǎo)花色苷合成的信號分子，在黃連木葉片[27]、紫葉稠李葉片[28]、草莓[29]及蘋果[30]等中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象?；ㄉ蘸铣伤璧奶脊羌苡商峭ㄟ^糖酵解途徑提供，可溶性糖為花色苷合成提供前體物質(zhì)，因此其含量增加對花色苷積累具有促進(jìn)作用[31]。

本次研究發(fā)現(xiàn)花色苷合成并不會降低揮發(fā)性物質(zhì)的含量，即并不抑制揮發(fā)性物質(zhì)的合成。實(shí)驗結(jié)果顯示：花色苷合成后，有血血橙的花色苷含量顯著高于無血血橙，但揮發(fā)性物質(zhì)組分幾乎沒有變化，大部分組分的含量卻上升。感官評定結(jié)果也顯示有血血橙香氣更為濃郁，受喜愛程度更高。柑橘果實(shí)主要的香氣成分為萜烯類物質(zhì)，經(jīng)由氧化作用從糖生成丙酮酸再到乙酰輔酶A，為萜烯類化合物的兩種合成途徑供給原料?；ㄉ蘸铣膳c糖類物質(zhì)含量有關(guān)，而糖是揮發(fā)性物質(zhì)的前體物質(zhì)，由此推測兩種化合物在復(fù)雜的生物合成途徑存在著某種關(guān)聯(lián)作用。因此基于本研究結(jié)果分析，糖作為揮發(fā)性物質(zhì)和花色苷的合成原料，它起到的促進(jìn)作用掩蓋了揮發(fā)性物質(zhì)和花色苷在生物合成途徑上可能存在的競爭關(guān)系，致使花色苷合成對揮發(fā)性物質(zhì)含量沒有造成影響。