超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定飲料中2種生物堿和6種甜味劑

劉紅，王林，胡博，李麗霞，黃偉，劉蕓,3*

1(湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢，430075)2(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢，430065)3(武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢，430072)

目前市場的飲料品種繁多，為了使其具有更好的口感和更好的功能作用，不法商家違規(guī)濫用、超范圍使用添加劑?？Х纫蚺c茶堿屬于生物堿類，可樂型碳酸飲料、茶、咖啡及植物類飲料中含有上述一種或兩種成分。適量的攝入，可緩解緊張情緒，改善血管功能，利尿，擴(kuò)血管；過量攝入，則會產(chǎn)生心動過速、高血壓、胃病、失眠等不良反應(yīng)[1]。糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜和三氯蔗糖是飲料中常用的非糖類甜味劑，一般甜度很高，用量極少[2]。2017年10月31日《關(guān)于愛德萬甜等6種食品添加劑新品種、環(huán)己基氨基磺酸鈉(又名甜蜜素)等6種食品添加劑擴(kuò)大用量和使用范圍》的公告(2017年第8號)中增補(bǔ)新型甜味劑愛德萬甜[3]，在茶、咖啡、植物(類)飲料中的限量為0.003 g/kg，固體飲料的限量為0.004 g/kg。

咖啡因和非糖類甜味劑檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)[4-9]采用不同的檢測方法。糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、咖啡因和三氯蔗糖均采用高效液相色譜法，其中，糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜和咖啡因使用紫外檢測器或二極管陣列檢測器，三氯蔗糖使用蒸發(fā)光散射檢測器，且樣品的預(yù)處理方法各不相同。愛德萬甜和茶堿目前暫無國標(biāo)方法，愛德萬甜主要采用高效色譜法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]，茶堿主要采用高效色譜法[12]。可見，目前檢測上述幾種成分主要采用高效液相色譜法，且均只針對某種或某幾種成分的檢測，尚未見對同一樣品中2種生物堿和6種甜味劑同時進(jìn)行測定的報道。采用高效液相色譜法可能會遇到以下問題：(1)僅靠保留時間對色譜峰定性，對保留時間相近的色譜峰定性不準(zhǔn)確；(2)很難排除復(fù)雜基質(zhì)樣品中基質(zhì)對成分的干擾。因此，建立一種能同時測定這些成分，且定性定量準(zhǔn)確的方法十分必要。本實(shí)驗超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,UPLC-MS/MS)，能在較短的時間內(nèi)對2種生物堿和6種甜味劑進(jìn)行一次性的分離和測定，填補(bǔ)了飲料中新型甜味劑愛德萬甜和2種生物堿同時測定的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純)，默克股份兩合公司；甲酸銨、甲酸(色譜純)，Aladdin公司；乙酸銨(色譜純)，Macklin公司。愛德萬甜(含量≥97.0%)，美國SIGMA公司；糖精鈉(1.0 g/L)，中國計量科學(xué)研究院；安賽蜜(1.0 g/L)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；三氯蔗糖(含量為98.5%)，德國Dr Ehrenstorfer公司；阿斯巴甜(含量為97.7%)，德國Dr Ehrenstorfer公司；紐甜(含量100%)，美國stanford公司；咖啡因(含量為100%)、茶堿(含量為100%)，中國檢驗測疫科學(xué)研究院。

10批樣品(3批茶飲料和7批果蔬汁)，均來源2018年湖北省抽檢樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

XEVOTMTQ-S液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，美國Waters公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；LC-250超聲波清洗機(jī)，山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司；臺式離心機(jī)，德國Thermo Biofuge公司；ACQUITY UPLC?BEH C18，美國Waters公司；XP504電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取一定量各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。臨用時，用空白樣品提取液逐級稀釋，根據(jù)每種目標(biāo)化合物的定量限，配制成不同濃度的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 前處理方法

精確稱取1.0 g樣品置于10 mL比色管中，加入V(乙腈)∶V(水)=20∶80混勻，定容至刻度，超聲10 min，以10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

1.3.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；進(jìn)樣量2 μL；柱溫35 ℃；流速0.3 m/min；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～2.00 min，97%A～90%A；2.00～8.00 min，90%A～60%A；8.00～10.00 min，60%A～10%A；10.00～10.10 min，10%A～97%A；10.10～13.00 min，97% A；離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正負(fù)離子掃描；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓3.5 kV；去溶劑溫度350 ℃；去溶劑氣流速800 L/Hr。詳細(xì)的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取的優(yōu)化

8種目標(biāo)化合物中，咖啡因和愛德萬甜更易溶于有機(jī)溶劑，其他6種易溶于水，所以選擇了乙腈∶水的體積比分別為：2∶8、5∶5、8∶2等3種提取液，對8種目標(biāo)化合物的提取回收率進(jìn)行比較。結(jié)果表明，阿斯巴甜、紐甜、愛德萬甜、三氯蔗糖和咖啡因3種溶劑提取回收率相近。當(dāng)提取溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時，糖精鈉，安賽蜜的回收率顯著下降；當(dāng)提取溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)≥50%時，茶堿回收率顯著下降?；厥章氏陆档脑蚩赡苁?種物質(zhì)均為水溶性，有機(jī)相比例增大時，降低了提取效率。故本文選用V(乙腈)∶V(水)=2∶8作為提取溶劑。

表1 八種化合物的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS parameters for 8 target compounds

注：*表示定量離子對。

圖1 三種提取溶劑提取回收率的比較Fig.1 Comparison of the recovery of three extracting solvents

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動相的選擇對于目標(biāo)物的分離、靈敏度以及峰形有較大的影響。本文考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.01 mol/L甲酸銨溶液、乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.05%甲酸)和乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液四種流動相體系，見圖2。

圖2 四種流動相體系的比較Fig.2 Comparison of four mobile phase systems

結(jié)果表明,以乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相體系時，8種目標(biāo)化合物的響應(yīng)均優(yōu)于其他流動相體系，且峰形較好。故選擇乙腈-0.1 %甲酸溶液作為流動相體系。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正離子和負(fù)離子模式下對各質(zhì)量濃度為200 ng/mL的目標(biāo)化合物單一對照溶液進(jìn)行全掃描，選出合適的電離方式及母離子；在確定ESI離子監(jiān)測模式后，分別以分子離子為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，選取豐度較強(qiáng)及干擾較小的2個子離子分別作為定量離子和定性離子；以子離子掃描(daughter scan)方式，優(yōu)化了目標(biāo)化合物二級質(zhì)譜的碰撞能量等質(zhì)譜分析參數(shù)(表1)，色譜圖見圖3。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的定量離子色譜圖Fig.3 Quantitative ion chromatograms of mixed standards

2.4 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)

評價基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除被分析物以外的化合物在分析過程中對目標(biāo)物有顯著干擾，并影響結(jié)果準(zhǔn)確性的現(xiàn)象。以典型樣品果蔬汁為樣品基質(zhì)，建立的快速測定方法中雖然采用V(乙腈)∶V(水)=20∶80提取溶液可以沉淀部分蛋白質(zhì)，但未對樣品溶液進(jìn)行凈化處理，可能存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，所以采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率百分比和樣品加標(biāo)回收率兩種方式來評價基質(zhì)效應(yīng)(ME)[13-15]。當(dāng)ME>100%時，基質(zhì)存在離子化增強(qiáng)作用；當(dāng)ME<100%時，基質(zhì)存在離子化抑制作用。結(jié)果見圖4。

圖4 飲料基質(zhì)對8種目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effect of 8 target compounds in drink

由圖4可見，安賽蜜、咖啡因和愛德萬甜存在離子化增強(qiáng)作用，糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜、茶堿和三氯蔗糖存在離子化抑制作用。由基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測定的加標(biāo)回收率可見，咖啡因和三氯蔗糖的溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率略優(yōu)于基質(zhì)標(biāo)曲回收率，其他6種目標(biāo)測定物基質(zhì)回收率均優(yōu)于溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率。雖然基質(zhì)效應(yīng)值在85%～115%，為了獲取更準(zhǔn)確的定性、定量結(jié)果，綜合考慮加標(biāo)回收率結(jié)果，本文采用系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析。

2.5 檢出限、定量限和線性范圍

用飲料空白樣品按照1.3節(jié)前處理方法得到樣品提取液，根據(jù)目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)弱配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列、以目標(biāo)化合物的色譜峰面積Y對其質(zhì)量濃度x(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，用空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，直到獲得每種目標(biāo)化合物的信噪比S/N≥3和S/N≥10的濃度，確定其為該化合物的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations，linear ranges and correlation coefficient

飲料中各目標(biāo)化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限為0.009～0.5 mg/kg，定量限均為0.03～2 mg/kg。與咖啡因和非糖類甜味劑檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)相比較，其靈敏度顯著提高(表3)。

表3 本方法與國標(biāo)方法的LODs和LOQs比較Table 3 Comparison of LODs and LOQs with the method and national standards

注：“-”表示沒有檢出。

2.6 回收率與精密度

在空白飲料樣品添加8種標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為LOQ、3LOQ和5LOQ，每個添加水平平行分析6次，平均回收率為92.3%～110.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.9%～10.8% (n=6)(見表4)。

表4加標(biāo)樣品的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n= 6)Table 4 Recoveries and RSDs of target compoudsad- vantame in spiked samples

2.7 實(shí)際樣品測定

采用本文建立的方法對市售的10個飲料樣品進(jìn)行前處理(3個茶飲料，7個果蔬汁飲料)，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行了檢測，其中3個樣品檢出咖啡因和茶堿，1個樣品檢出安賽蜜和阿斯巴甜，其他成分未檢出，結(jié)果見表5。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜快速測定飲料中2種生物堿和6種甜味劑的方法。以V(乙腈)∶V(水)=20∶80超聲提取樣品后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證和10個實(shí)際樣品的測定。該方法簡單、快速，靈敏，準(zhǔn)確，其定量限低于國家標(biāo)準(zhǔn)，適用于飲料中2種生物堿和6種甜味劑檢測，填補(bǔ)了飲料中新型甜味劑愛德萬甜和2種生物堿同時測定的空白，可為食品安全監(jiān)管提供有效保障。

表5 樣品測定結(jié)果表 單位：mg/kgTable 5 The results of the samples

注：ND表示沒有檢出。