響應面法優(yōu)化丹磺酰氯衍生生物胺的衍生條件

李冉冉，李洪軍,2，賀稚非,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

生物胺(Biogenic amines,BAs)是一類低分子量的含氮有機化合物，不具揮發(fā)性[1],熱穩(wěn)定性強，廣泛存在于植物、動物和人體中。BAs根據(jù)其結構不同可分為3類：脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺)、芳香族(色胺、β-苯乙胺)和雜環(huán)族(組胺、酪胺)[2]。BAs作為一種有機堿，是細胞應對酸脅迫的產(chǎn)物，它是通過微生物(主要是細菌)產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用于相應的氨基酸產(chǎn)生的[3]，氨基酸脫羧酶使氨基酸脫去α-羧基產(chǎn)生相應的胺和CO2,如組氨酸脫羧生成組胺，酪氨酸脫羧生成酪胺，而腐胺則是由鳥氨酸(由谷氨酸和精氨酸轉化而成)脫羧而成，并且可在亞精胺合成酶作用下進一步生成亞精胺[4]。不同的微生物可誘導不同BAs的產(chǎn)生，據(jù)報道，在大部分發(fā)酵食品中，革蘭氏陰性菌、腸桿菌和假單胞菌是導致組胺、腐胺和尸胺積累的主要微生物[5]，而在發(fā)酵肉制品中，由于在發(fā)酵過程中革蘭氏陰性菌往往被抑制，因此革蘭氏陽性菌，尤其是乳酸菌，是產(chǎn)生BAs的主要菌株[6]。

低濃度的生物胺具有生理活性，在人體中起著重要作用，它能夠調節(jié)人體代謝，參與核酸和蛋白質的合成[7]，但其含量積累到一定程度則會對人體有害，這是生物胺成為研究熱點的主要原因之一。在BAs中，毒性最強的是組胺和酪胺，二者都具有細胞毒性作用，但作用方式顯著不同。腐胺和尸胺是通過抑制組胺降解來間接增加組胺毒性，并且，據(jù)報道，腐胺的含量與胃癌的出現(xiàn)有密切的相關性[8]，因此高效監(jiān)測食品中的BAs以及制定限量標準成為當務之急。

目前，國內外用于檢測食品中生物胺的常用方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法、生物傳感器法等[9]。近幾年，出現(xiàn)的新型檢測方法有納米纖維膜試紙技術[10]、競爭性熒光分子印跡聚合物(MIP)技術[11]、高光譜成像技術[12]等。高效液相色譜法具有柱效高、定量分析準確、靈敏度高等優(yōu)點，因此依舊是最常用的生物胺分析檢測技術。高效液相色譜檢測生物胺面臨的最大問題在于生物胺沒有顯著的紫外吸收峰，也不具備熒光特性，因此需要對生物胺進行衍生處理，衍生分為柱前衍生和柱后衍生2種，因柱后衍生設備昂貴、衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、易分解，所以國內外目前廣泛采用柱前衍生。丹磺酰氯和苯甲酰氯是最常用的生物胺柱前衍生劑[13],苯甲酰氯衍生溫度低，時間短，但衍生產(chǎn)物不如丹磺酰氯衍生穩(wěn)定。NGELA等[14]采用中心復合設計優(yōu)化了苯甲酰氯衍生生物胺的條件，研究表明，衍生劑體積和溫度是影響苯甲酰氯衍生的最主要因素，在20 ℃，用量15 μL條件下衍生效果最好。LIU等[15]對丹磺酰氯和苯甲酰氯衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性進行了對比分析，結果表明，苯甲酰氯的衍生物需要存放在4 ℃條件下，才能避免酪胺等衍生物的降解，而丹磺酰胺在4和25 ℃下保藏均能保持良好的穩(wěn)定性。因此，丹磺酰氯更適合進行樣品批處理。但不同的研究者在使用丹磺酰氯進行生物胺衍生時，采用的條件，即衍生溫度、衍生時間、衍生劑體積等往往差異很大。

雖然也有研究者優(yōu)化生物胺的衍生條件，但并沒有人探究過不同衍生因素之間的交互作用，而且在研究過程中往往以單個生物胺為考慮因素，而被檢測樣品中常含多種生物胺，所以實際意義可能并不大。因此本試驗采用響應面法來優(yōu)化丹磺酰氯的衍生條件，同時對衍生過程中3個關鍵因素：衍生溫度、衍生時間和衍生劑用量之間的交互作用進行研究，以8種生物胺總面積為響應值，探討衍生因素對多種生物胺衍生效果的綜合影響，并在試驗過程中對8種生物胺總面積作為響應值的合理性進行了驗證，以期為生物胺衍生條件的優(yōu)化提供科學、直觀的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8種生物胺標準品(色譜純)：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺，純度均大于99%，購買于美國Sigma公司；丹磺酰氯、甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)，購自重慶市鈦新化工有限公司；HCl、NaOH、NaHCO3、NH3·H2O、丙酮、NaCl、三氯乙酸、正己烷均為分析級，購自上海源葉生物科技有限公司；娃哈哈純凈水、新鮮豬后腿肉、輔料(食鹽，食品級NaCl、KCl、抗壞血酸鈣，料酒、十三香、復合磷酸鹽等)，購自重慶市北碚區(qū)天生街道永輝超市；食品級Ⅱ-普通山楂核煙熏香味料，購買于濟南華魯食品有限公司。

1.2 儀器與設備

FA114A電子分析天平，上海?？倒荆籐ab Dancer漩渦混合器，德國IKA公司；HH-6富華數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機，寧波SCIENTZ生物科技有限公司；L16M冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；LC-AD高效液相色譜儀，配有DGU-20A3自動過濾器、SPD-M20A PDA檢測器、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱，日本SHIMADZU公司；ChromplusTM C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，美國SWELL公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品及試劑的配制

標準品及試劑的配制參照陸永梅[16]和LI等[17]的方法，并稍作修改。

1.3.1.1 試劑的配制

1 mol/L HCl：量取8.6 mL鹽酸于100 mL容量瓶中，用娃哈哈純凈水定容；0.1 mol/L HCl：用10 mL移液管吸取10 mL 1 mol/L HCl于100 mL容量瓶中，用娃哈哈純凈水定容;2 mol/L NaOH：稱取8 g NaOH于燒杯中，用適量水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，加水定容；飽和NaHCO3:在100 mL水中加入NaHCO3，直至其不再溶解，所得上清液即為飽和NaHCO3溶液；10 mg/mL丹磺酰氯：準確稱取0.5 g丹磺酰氯于50 mL燒杯中，加入適量丙酮溶解，將溶解液轉移至50 mL容量瓶中，燒杯用丙酮清洗3次，并將清洗液轉移至容量瓶中，最終用丙酮定容。

1.3.1.2 生物胺標準品的配制

生物胺混標使用液的配制：使用移液器分別吸取1 000 μL色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、組胺、亞精胺、精胺的單標儲備液(1 000 μg/mL)置于同一個10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L HCl稀釋至刻度，混勻，配制成100 μg/mL的含8種生物胺的混合使用液，存放在4 ℃冰箱保存。20 μg/mL生物胺使用液的配制：用移液槍移取2 mL 100 μg/mL的混標使用液，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L HCl稀釋至刻度。

1.3.2 色譜條件

ChromplusTM C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量20 μL；流動相A為娃哈哈純凈水，流動相B為色譜級乙腈，梯度洗脫程序如表1所示。有機相所占的比例在最初20 min一直在增加，隨后保持最初比例直至洗脫結束，通過改變有機相的占比達到充分快速洗脫生物胺的目的。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for biogenic amines analysis

1.3.3 衍生程序

吸取1 mL 20 μg/mL的生物胺混標溶液于10 mL離心管中，加入200 μL NaOH、300 μL飽和NaHCO3，使溶液呈堿性。渦旋振蕩10 s后，加入適量10 mg/mL的丹磺酰氯，此時會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，這表明衍生劑質量較好，并可用。將混合液渦旋20 s后放入水浴鍋中，避光衍生。

衍生結束后，在混合液中加入100 μL NH3·H2O，混勻后，放入25 ℃水浴鍋中進行終止反應。30 min后取出，用乙腈定容至5 mL,于4 ℃冷凍離心機中離心(3 000 r/min,10 min)。離心結束后，用2 mL注射器吸取上清液，過0.22 μm濾膜，然后注入1.5 mL進樣小瓶中，待檢測。

1.3.4 單因素試驗設計

不同研究者采用丹磺酰氯衍生生物胺時，使用的衍生條件差異較大，最高的衍生溫度可達65 ℃，時間為30 min[19]，國內外以40 ℃,45 min[20-21]或45 ℃,60 min[15]作為衍生條件的較多，根據(jù)預試驗，確定研究水平為衍生溫度30、35、40、45、50 ℃；衍生時間25、30、35、40、45 min；衍生劑體積2、2.5、3、3.5、4 mL,以8種生物胺總面積為響應值。每組試驗測定的指標均做3次平行。

1.3.5 衍生條件優(yōu)化的響應面設計

根據(jù)單因素試驗結果，以衍生溫度(A)，衍生時間(B)，衍生劑體積(C)為自變量，以生物胺總面積值(Y)為響應值，采用Design- Expert 8.06進行Box-Behnken試驗設計，因素水平如表2所示。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels used in response surface design

1.3.6 低鹽臘肉樣品中生物胺的檢測

1.3.6.1 低鹽臘肉的制備

低鹽臘肉的制備參照柴子惠[22]的方法并稍作修改。選擇肥瘦層次明顯的新鮮豬后腿肉，去除淤血、筋膜，修整成瘦薄均勻、重約200 g的長條狀肉塊。將肉塊浸泡在腌制液中，于10 ℃氣溫箱下密封腌制5 d，每隔24 h翻面一次，使肉塊腌制均勻；腌制結束后，用適當溫水洗去肉樣表面雜質，采用液熏液液熏180 min；液熏結束后，于50 ℃烘箱中烘烤48 h，每隔12 h調整一下位置，使肉塊受熱均勻；將烘烤后的肉樣取出，于自然條件下晾掛5 d，完成后熟即為成品，將樣品儲存在-18 ℃，待檢測。

1.3.6.2 樣品中生物胺的提取

樣品生物胺的提取參照LIU等[15]的方法并稍作修改。取5 g(精確至0.01 g)絞碎的低鹽臘肉，置于50 mL平底試管中，加入20 mL 5%的三氯乙酸溶液，均質處理1 min，獲得勻漿，轉移至100 mL具塞錐形瓶中，采用振蕩提取方式(30 ℃，130 r/min)提取30 min后,轉移至50 mL具塞離心管中離心(8 000×g,10 min,4 ℃),并將上清液轉移至50 mL容量瓶中。殘渣用提取試劑再提取1次，合并上清液，用提取試劑定容。

1.3.6.3 除脂

移取10 mL上述試樣提取液于50 mL具塞試管中，加入0.5 g NaCl，待NaCl完全溶解后加入10 mL正己烷，渦旋振蕩3 min，靜置分層后棄去上層有機相，將下層試樣溶液中加入10 mL正己烷,重復上述操作。

1.3.6.4 樣品的衍生

樣品的衍生采用上述響應面優(yōu)化的衍生條件。具體衍生操作同標品。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 17.0進行單因素方差分析，取置信度95%(P<0.05)，采用Origin 2017繪圖。

2 試驗結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 衍生溫度對衍生效果的影響

在衍生時間為35 min、衍生劑添加量為3 mL時，以8種生物胺總面積為響應值，由圖1可知，當衍生溫度小于35 ℃時，隨著溫度的升高，生物胺總面積呈下降趨勢，當衍生溫度介于35至40 ℃時，隨著溫度的升高，生物胺總面積值顯著(P<0.05)升高，40 ℃時，達到最大；當繼續(xù)升高衍生溫度時，生物胺總面積則逐漸降低。這表明，適當升溫會加快反應的進行，但溫度過高則會影響丹磺酰胺的穩(wěn)定。劉景等[23]在研究衍生溫度對丹磺酰氯衍生組胺的影響時也發(fā)現(xiàn)適當升溫會使衍生產(chǎn)物顯著升高，但當溫度超過60 ℃時，衍生產(chǎn)物則顯著降低，但由于不同生物胺的熱穩(wěn)定性不同，因此最佳衍生溫度對單胺來說并不固定。同時，有研究證實，高溫導致丹磺酰胺的降解，在衍生物熱穩(wěn)定性方面，丹磺酰氯的衍生產(chǎn)物丹磺酰胺的耐高溫能力比大四酰氯的衍生產(chǎn)物大四酰胺弱[24]。

圖1 衍生溫度對8種生物胺總面積的影響Fig.1 Effect of derivatization temperature on the total area of 8 kinds of biogenic amine

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在進行溫度單因素試驗時，8種生物胺中3種生物胺組胺、亞精胺、精胺的面積始終低于其他胺。為保證在生物胺總面積達到最大時，所有生物胺的面積盡可能均達到最大，由圖2可知，這3種胺的總面積隨溫度的變化趨勢與8種生物胺總面積的變化趨勢幾乎一致，而且也在40 ℃時達到最大值。這證實以生物胺總面積作為衍生溫度的響應值是合理的。

圖2 衍生溫度對3種生物胺總面積的影響Fig.2 Effect of derivatization temperature on total area of 3 kinds of biogenic amines

2.1.2 衍生時間對衍生效果的影響

在衍生溫度為40 ℃、衍生劑添加量為3 mL時，以8種生物胺總面積為響應值，由圖3可知，當衍生時間在25～35 min時，隨著衍生時間的延長，生物胺總面積顯著增加，這表明在此段時間范圍內，生物胺并未完全反應。當反應時間達到35 min時，生物胺總面積達到最大，隨著時間的繼續(xù)延長，生物胺總面積趨于穩(wěn)定。這表明丹磺酰氯與生物胺反應存在飽和時間，此時二者反應已完全，繼續(xù)延長反應時間無意義甚至出現(xiàn)負面效果。該結果與劉景[23]、吳迪[25]、董偉峰等[26]的類似。

圖3 衍生時間對8種生物胺總面積的影響Fig.3 Effect of derivatization time on total area of 8 kinds of biogenic amine

在進行時間單因素試驗時，8種生物胺中3種生物胺組胺、亞精胺、精胺的面積始終低于其他胺。因此本研究以這3種生物胺的總面積作為響應值，由圖4可知，研究表明，3種生物胺總面積值隨著衍生時間的延長呈現(xiàn)先增大后降低然后趨于穩(wěn)定的趨勢，在30 min時達到最大，35 min時有所降低，但二者之間并無顯著差異。因此，選擇生物胺總面積作為衍生時間的響應值是有效的。

圖4 衍生時間對3種生物胺總面積的影響Fig.4 Effect of derivatization time on total area of 3 kinds of biogenic amine

2.1.3 衍生劑體積對衍生效果的影響

在衍生溫度為40 ℃，衍生時間為35 min時，以8種生物胺總面積為響應值，由圖5可知，當衍生劑用量小于3 mL時，隨著衍生劑用量的增大，生物胺總面積值顯著(P<0.05)增大，此時組胺、亞精胺、精胺的面積值仍小于其他5種生物胺。當衍生劑用量為3 mL時，生物胺總面積極顯著(P<0.01)增大；當繼續(xù)增大衍生劑的用量，生物胺總面積先降低后趨于穩(wěn)定，此結果與吳迪等[25]類似。當衍生劑大于等于3 mL時，各生物胺的面積變化無明顯規(guī)律，組胺、亞精胺、精胺不再是8種生物胺中響應值最小的3種生物胺，但通過試驗表明，各生物胺的面積均在衍生劑體積為3 mL時達到最大，因此選擇8種生物胺總面積值作為研究衍生劑體積對衍生效果的影響是可靠的。

圖5 衍生劑體積對生物胺總面積的影響Fig.5 Effect of derivatizer volume on total area of 8 kinds of biogenic amine

通過上述單因素試驗表明，在多種生物胺同時存在時，丹磺酰氯對不同胺的敏感程度可能不同，其對多胺(精胺、亞精胺)和組胺的反應能力要弱于其他胺。當反應時間并不充足，丹磺酰氯添加量不足時，這種現(xiàn)象尤為明顯，而當反應時間最佳，反應溫度適宜時適當增加丹磺酰氯的添加量可使這種差異性完全消失。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 Box-Behnken試驗結果

根據(jù)上述實驗結果，分別選取衍生溫度(A)、衍生時間(B)、衍生劑體積(C)中的高中低3水平進行Box-Brhnken響應面分析試驗，其結果如表3所示。

2.2.2 多元回歸模型的建立及顯著性分析

對表3中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到以生物胺總面積(Y)為響應值的回歸方程(1)如下：

表3 響應面設計及試驗結果Table 3 Response surface design arrangement and experimental results

Y=4 602 000+1 458.88A-37 036.37B-6 056.00C-55 592.25AB-58 068.00AC-94 072.50BC-234 900A2-308 100B2-202 100C2

(1)

對回歸方程進行方差分析，結果見表4。

表4 生物胺總面積二次方模型回歸方差分析Table 4 Anlysis of variance (ANOVA)for regression equation

注：*-差異顯著(P<0.05);**-差異極顯著(P<0.01)。

由表4可知，方程的一次項A、B、C對Y的影響不顯著；二次項A2、B2對Y的影響均為極顯著(P<0.01),C2對Y的影響為顯著(P<0.05)；交互項中AB、AC對Y的影響均為不顯著，而BC對Y的影響顯著，且P值為0.012 6，這表明衍生時間和衍生劑用量在生物胺衍生過程中存在協(xié)同增效作用，而衍生溫度與衍生時間、衍生溫度和衍生劑用量之間則無此作用。由F值可知，3個因素對生物胺總面積影響的強弱順序為B、C、A,即衍生時間、衍生劑用量、衍生溫度；且衍生時間與衍生劑用量(BC)具有較強的交互作用。

2.2.3 響應面因素交互作用分析

如表4所示，當以8種生物胺總面積為響應值時，衍生溫度與衍生時間并無交互作用，這與劉景等[23]的研究結果相悖，可能是由于其研究是以組胺單胺為主，而本研究則考慮衍生因素對多種生物胺衍生效果的綜合影響，并且有研究表明不同生物胺的熱穩(wěn)定性不同[28]，當研究的生物胺種類和數(shù)量不同時，即使溫度一致，最佳時間也會有顯著差異[26,29]，這也證實當考慮衍生因素對多種生物胺的綜合影響時，衍生溫度和衍生時間并無顯著交互作用。

在響應面中，坡度、等高線形狀反映了因素對響應值的影響強弱，坡度越陡表明因素對響應值的影響越大，等高線呈橢圓形則意味著兩因素交互作用對響應值影響大[30]。響應面分析表明，BC，即衍生時間與衍生劑用量具有顯著交互作用，響應面和等高線圖如圖6所示。由圖6可知，生物胺總面積的最大值位于響應面的中心，并且衍生時間和衍生劑體積的交互作用等高線圖呈明顯的橢圓形，說明二者交互作用顯著，對生物胺總面積有顯著影響。當衍生劑體積用量3 mL和衍生時間35 min左右時，生物胺總面積值達到最大，表明此條件下衍生效果最好；當?shù)せ酋Ｂ扔昧啃∮? mL,衍生時間小于35 min時，生物胺總面積隨著二者的增加而增加，表明在此范圍內，衍生劑用量與衍生時間具有協(xié)同作用，延長衍生時間有利于丹磺酰氯與生物胺的充分反應；當衍生劑用量大于最佳添加量，衍生時間延長至超過最佳反應時間時，隨著二者的增加，生物胺總面積值先降低后趨于穩(wěn)定，這可能是由于反應時間的延長會降低衍生劑的效力，或是由于更復雜的原因，即反應時間的延長提高了衍生物對溫度的敏感性，因此導致生物胺總面積的降低，但其具體機理尚不明確，有待進一步研究。

圖6 BC交互作用的響應面和等高線圖Fig.6 Contour and response surface plots showing the interactive effects of BC

2.3.4 響應面生物胺衍生程序優(yōu)化及驗證試驗

通過模型進行優(yōu)化，得出生物胺衍生程序的最佳參數(shù)為衍生溫度40.06 ℃、衍生時間34.70 min、衍生劑體積3 mL,由模型得到生物胺總面積的預測值為4 602 988。結合實際實驗的可操作性，將最優(yōu)衍生參數(shù)調整為衍生溫度40 ℃、衍生時間35 min,衍生劑體積3 mL。使用上述參數(shù)進行驗證試驗，得到生物胺總面積為4 600 771，與預測值的吻合率達到100.05%，說明該模型能較好地預測生物胺的衍生效果，具有較高參考價值。

2.3.5 8種生物胺色譜圖

按上述優(yōu)化的衍生條件處理20 μg/mL的生物胺混標溶液，然后進行高效液相色譜檢測，結果如圖7所示。序號1-8，分別代表色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺。

1-色胺；2-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-組胺；6-酪胺；7-亞精胺；8-精胺圖7 八種生物胺標準品的色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of standard solutions of 8 kinds of biogenic amine

2.3.6 低鹽臘肉中的生物胺

采用響應面法優(yōu)化的衍生條件衍生低鹽臘肉樣品中的生物胺，結果如圖8所示。在低鹽臘肉成品中，8種生物胺均被檢出，其中精胺和苯乙胺含量最高，分別為51.30、47.67 mg/kg，尸胺含量最低，為2.45 mg/kg。腐胺、組胺、酪胺、亞精胺含量差異則不顯著(P<0.05)，其含量分別為10.56、13.89、12.59、11.20 mg/kg。低鹽臘肉中生物胺的種類和含量與原料肉的衛(wèi)生條件和具體的加工工藝有關。采用此方法衍生臘肉中的生物胺數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定。

圖8 低鹽臘肉中的生物胺Fig.8 BAs concentrations in low-salt bacon

3 結論

食品中生物胺產(chǎn)生需要具備3個條件：(1)可利用的氨基酸前體(2)氨基酸脫羧酶(3)產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物。因此，發(fā)酵食品(如奶酪、酒類、醬類和香腸、臘肉等發(fā)酵肉制品)是生物胺積累的合適底物，也是監(jiān)測的主要對象。由于生物胺本身的特性，導致其檢測前需要進行衍生處理。生物胺衍生使用最多的是丹磺酰氯，其衍生過程受到衍生溫度、衍生時間、衍生劑用量等條件的制約，而不同學者在研究生物胺時，采用的衍生條件各異。本試驗采用Box-Behnken設計，以生物胺總面積為響應值，優(yōu)化了衍生過程中所用衍生溫度、衍生時間、衍生劑用量的最佳值，方差檢驗表明所建模型回歸效果極顯著，擬合度良好，可用于最優(yōu)衍生條件的預測。通過回歸優(yōu)化結合具體實驗操作得出，使用10 mg/mL丹磺酰氯衍生20 μL/mL的生物胺混標工作液，在衍生溫度為40 ℃、衍生時間35 min、衍生劑添加量3 mL時，衍生物產(chǎn)率最高。此衍生條件可用于有效檢測樣品中的多種生物胺。