枳椇水提液改善慢性酒精性肝損傷作用研究

楚勝，李傳俊

（漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南 漯河 462000）

0 引言

枳椇(Hovenia) 屬鼠李科(Rhamnaceae) 枳椇屬(Hovenia)植物干燥成熟的種子，學名枳椇子，枳椇在1500 多年前我國已作為藥用，載于《唐本草》，藥用部分為帶有肉質(zhì)果柄的果實或種子。至近現(xiàn)代,藥用部位從枝木及花序軸發(fā)展到果實和種子,而功效基本一致[1]。《本草綱目》中記述：枳椇功用同蜂蜜；可解酒毒，辟蟲毒。

當今社會，社交場合，存在普遍飲酒現(xiàn)象。長期飲酒導致體內(nèi)放生酒精慢性蓄積，作為酒精代謝的主要場所，發(fā)生酒精性肝損傷的勢頭很猛[2]。為了減輕長期飲酒者酒精對肝損傷影響，本文通過建立小鼠慢性酒精性肝損傷模型，觀察給予枳椇水提物灌胃慢性酒精性肝損傷模型小鼠生化指標的變化以及肝組織脂肪變性程度，研究枳椇水提物對慢性酒精性肝損傷模型小鼠的作用，為因飲酒導致的肝損傷者尋找具有保肝護肝功效的藥食物提供一些建議。

1 實驗材料與儀器

1.1 試劑

超氧化物歧化酶(SOD)測試試劑盒、丙二醛(MDA)測試試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)測試試劑盒、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測試試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；56 度白酒，北京紅星股份有限公司；生理鹽水，華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；枳椇水提液：低劑量（1 mg/mL）、中劑量（2 mg/mL）、高劑量（4 mg/mL）；蘇丹Ⅲ染色劑。

1.2 動物

購買昆明種雄性小鼠，飼養(yǎng)于漯河醫(yī)專動物房，飼養(yǎng)期間控制溫濕度，溫度20～26 ℃，相對濕度為35%～70 %。

1.3 儀器

旋轉蒸發(fā)儀R-1005，鄭州紫拓儀器設備有限公司；BLOBASE-EL10A 多功能酶標儀，濟南高奎醫(yī)療器械有限公司；Happy-TL16 臺式離心機，濟南福的機械有限公司；超凈工作臺，東莞雅寧公司；顯微鏡YRS-32，上海遠仞檢測設備有限公司；KD-2850 冷凍切片機，北京世紀科信科學儀器公司。

2 方法

2.1 實驗方法

2.1.1 枳椇水提液

枳椇碾成粗粉，用水浸提24 h,浸提液保存待用；濾渣加水煎煮兩次,過濾合并兩次濾液；提合并浸提液、煎煮液后，置于旋轉蒸發(fā)儀內(nèi)，濃縮為濃縮液，置于冰箱內(nèi)備用。實驗前取適量濃縮液加水稀釋成含枳椇1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL 水提液，待用。

2.1.2 慢性酒精性肝損傷實驗

選取昆明種雄性小鼠40 只，稱重（25±2）g，隨機分成五組，枳椇水提液低、中、高劑量組、模型組和正常組，每組8 只。實驗用小鼠除正常對照組外，其他組小鼠按任彬彬等[3]造模方法，每日用56 度白酒灌胃，劑量10 mL/kg，連續(xù)3 周。慢性酒精性肝損傷模型建模成功，開始實驗，枳椇水提物低劑量組、枳椇水提物中劑量組、枳椇水提物高劑量組分別用1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL 的枳椇水提液罐胃，1 次/d,0.5 mL/次，連用15 d；正常組和模型組用純化水罐胃，1 次/d,0.5 mL/次，連用15 d。最后一次罐胃2 h 后開始進行生化指標檢測。

2.2 實驗指標及檢測方法

2.2.1 實驗指標

選取小鼠血清谷草轉氨酶（AST）含量、谷丙轉氨酶（ALT）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及肝組織脂肪變性評分作為本實驗的指標。

2.2.2 實驗指標檢測

摘除小鼠眼球取血，靜置，離心機3000/min，離心15 min 后取出血清，按試劑盒說明書要求操作，定量測定各組小鼠谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，結果詳見表1、表2。

2.2.3 肝組織病理學檢查

取肝葉冷凍切片，蘇丹Ⅲ染色劑，40×10 顯微鏡下觀察脂滴分布、范圍，進行肝組織病理學檢查評分。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 實驗結果與分析

3.1 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST 影響

表1 表明：不同劑量組與模型組組間比較，低劑量組ALT（P＜0.05）與模型組差異有統(tǒng)計學意義，ATS（P＞0.05）與模型組差異無統(tǒng)計學意義；中劑量組ALT（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學意義，ATS（P＞0.05）與模型組差異無統(tǒng)計學意義；高劑量組ALT（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學意義，ATS（P＜0.05）與模型組差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3.2 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清MAD、SOD 影響

表2 表明：不同劑量組與模型組組間比較，低劑量組MAD、SOD 指標P 值均大于0.05，與模型組差異無統(tǒng)計學意義；中劑量組MAD（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學意義，SOD（P＞0.05）與模型組差異無統(tǒng)計學意義；高劑量組中劑量組MDA（P＜0.01）與模型組差異有非常顯著統(tǒng)計學意義，SOD（P＜0.05）與模型組差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3.3 小鼠肝臟組織病理學檢查結果

蘇丹Ⅲ染色，顯微鏡下染成觀察橘紅色的脂滴，按照評分標準（橘紅色的脂滴散在、稀少為0分；含橘紅色的脂滴≤1/4 為1 分；含橘紅色的脂滴≤1/2 為2 分；含橘紅色的脂滴≤3/4 為3 分；含橘紅色的脂滴＞3/4 為4 分）。結果見表3。結果顯示，模型組與正常組有非常顯著統(tǒng)計學差異，說明動物建模成功；各劑量組與模型組比較，高劑量組有顯著的統(tǒng)計學差異，表明高劑量組緩解慢性酒精性肝損傷小鼠肝組織脂肪的變性。

表3 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠肝組織脂肪變性的影響（n=8,±s）

表3 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠肝組織脂肪變性的影響（n=8,±s）

注：與正常對照組比較，*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)；與模型組比較，#表示差異顯著(P＜0.05)，##表示差異極顯著(P＜0.01)。

4 討論

4.1 動物建模及實驗指標

模型組與對照組比較，生化指標ALT、ATS、MAD和SOD，以及肝組織病理學檢查評分指標均有非常顯著統(tǒng)計學意義差異（P＜0.01），說明慢性酒精性肝損傷小鼠建模成功，表明實驗中采用的任彬彬、李國莉、劉賀榮等[3]造模方法是有效的方法。

表1 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST 影響（n=8,±s）

表1 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清ALT、AST 影響（n=8,±s）

注：與正常對照組比較，*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)；與模型組比較，#表示差異顯著(P＜0.05)，##表示差異極顯著(P＜0.01)。

表2 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清MAD、SOD 影響（n=8,±s）

表2 枳椇水提液對慢性酒精肝損傷小鼠血清MAD、SOD 影響（n=8,±s）

注：與正常對照組比較，*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)；與模型組比較，#表示差異顯著(P＜0.05)，##表示差異極顯著(P＜0.01)。

飲酒者飲久后，進入機體的酒精可以引起體內(nèi)AST、ALT 含量升高[4-5]；酒精的代謝主要器官是肝，進入肝組織的酒精能引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化，從而影響肝功，而MDA 又是肝細胞膜脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物之一，故可以用肝組織中MDA 含量間接反映肝損傷的受損程度[6]；SOD 阻止肝損傷、修復損傷肝細胞，故SOD 活性可以反映肝受損速度及受損肝細胞修復能力[7]。綜上，本實驗選取血清ALT、AST 和MDA 含量及SOD 活性作為檢測肝損傷的生化指標[8]。

4.2 枳椇水提液對酒精性急性肝損傷小鼠保護作用

肝臟是酒精的主要代謝場所，因為只有肝臟內(nèi)才具有代謝酒精的特有酶類。酒精在機體代謝主要有3 條途徑：

（1）胞質(zhì)內(nèi)酒精脫氫酶（ADH）途徑

CH3CH2OH+氧化型輔酶Ⅰ→CH3CHO+還原型輔酶I+H+

（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體酒精氧化(MEOS)途徑

CH3CH2OH+氧化型輔酶Ⅱ+O2+H+→CH3CHO+還原型輔酶Ⅱ+2H2O

（3）過氧化小體上過氧化氫酶(CAT)途徑

CH3CH2OH+過氧化氫→CH3CH2O+2H2O

三種路徑酒精均被氧化成為乙醛，乙醛濃度過高損害肝臟并顯著降低肝臟對氧的利用，并加劇自由基介導的不良反應和脂質(zhì)過氧化作用。另外，酒精代謝產(chǎn)生還原型輔酶I、還原型輔酶Ⅱ影響糖代謝，產(chǎn)生氧自由基，引起肝細胞損傷[9-10]。模型組小鼠肝組織的MDA 升高非常顯著，SOD 活性降低也非常顯著。

枳椇水提液具有顯著增強小鼠肝臟乙醇脫氫酶活性的作用[11]，加快機體內(nèi)酒精代謝，降低酒精對肝臟的損傷。枳椇含有山奈酚、雙氫山奈酚、洋芹素、楊梅黃素、榭皮素等多個黃酮類化合物[12-13]，其有抗氧化、清除自由基的作用。實驗中枳椇水提液能夠降低肝損傷小鼠肝臟內(nèi)氧自由基，降低MDA 含量，提高SOD 活性，可能與枳椇含有的黃酮類成分有關。

小鼠肝臟組織病理學檢查結果表明，高劑量組緩解慢性酒精性肝損傷小鼠肝組織脂肪的變性。枳椇子含有枳椇皂苷A1、A2、B1、B2等皂苷雷成分，枳椇皂昔能明抑制組胺釋放[14]，故降低了肝臟的炎性反應，從而減輕或減緩肝臟的損傷。枳椇子水提取液能顯著提高肝細胞存活時間和增殖率，對肝細胞具有促生長活性[15]，進而減緩肝臟脂肪變性，加快受損肝細胞的修復。

綜上所述，枳椇水提液高劑量組對酒精性肝損傷具有保護作用，有利于酒精性肝損傷者肝細胞修復，值得在實踐中應用。但枳椇對于受損肝臟的保護作用的物質(zhì)基礎不夠清晰明確，建議繼續(xù)探討研究。