積雪草苷調(diào)控GRP78/PERK/CHOP通路對(duì)急性心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用研究?

楊 勇 殷紅珍 胡云飛

（1.安徽省滁州市第一人民醫(yī)院，安徽 滁州 239000；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院，安徽 蕪湖241000；3.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動(dòng)脈急性狹窄或者閉塞，引起供血驟然減少或者終止，心肌嚴(yán)重缺血或壞死的急性病證，AMI具有發(fā)病急、致殘率、死亡率高等特征［1］。凋亡是引起心肌細(xì)胞死亡的主要形式。近年來(lái)研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是除了線粒體和死亡受體通路外的另一細(xì)胞凋亡通路［2］。細(xì)胞在缺氧缺血等多種因素下會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白集聚，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78），進(jìn)而啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）反應(yīng)，促使未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白恢復(fù)正確構(gòu)象，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，但應(yīng)激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)啟動(dòng)ERS凋亡信號(hào)通路GRP78/蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）/轉(zhuǎn)錄因子C、EBP同源蛋白（CHOP），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。積雪草苷（AC）是中草藥積雪草的提取物。藥理研究表明，AC具有抗氧化、保護(hù)缺氧心肌細(xì)胞、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用［4］。AC可顯著改善心肌梗死大鼠的膠原異常表達(dá)和心肌纖維化作用［5］。目前關(guān)于AC對(duì)急性心肌梗死大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的研究較少，本研究通過(guò)制備急性心肌梗死大鼠模型，探究AC基于GRP78/PERK/CHOP通路對(duì)大鼠的心肌保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF8周齡級(jí)SD大鼠108只，體質(zhì)量230～260 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SYXK（豫）2018-0002；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則由專人飼喂，室內(nèi)溫度25℃，濕度60%，通風(fēng)良好。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：積雪草苷片（AC）（上海醫(yī)藥研究工業(yè)研究院，國(guó)藥準(zhǔn)字Z200541446），?；撬幔═au）（美國(guó)Sigma公司），Bax、Caspase-12、Caspase-3、Bcl-2單抗（美國(guó)CST公司），GRP78單抗（美國(guó)Sigma aldrich公司）、PERK、CHOP單抗（英國(guó)Abcam生物公司），羊抗鼠IgG二抗（Santa Cruz公司），2，3，5-苯氯化四氮唑（TTC）（美國(guó)Amresco公司），蘇木素、伊紅染液（美國(guó)Sigma公司），Trizol、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（invitrogen公司），BCA試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。2）儀器：1659001蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；GIS-500凝膠成像儀（Miulab公司），CFX96 PCR儀（美國(guó)BioRad公司），DW-2000小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司），3K15低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），SpectraMax M5酶標(biāo)儀（美國(guó)molecular devices公司）。

1.3 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，參考文獻(xiàn)［6］制備心梗模型，禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位固定，呼吸機(jī)輔助；左胸部縱切口開胸，小心分離心包膜，輕壓右側(cè)胸壁，暴露心臟，左心耳下1 mm處以7-0線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支近側(cè)端，結(jié)扎后肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖J點(diǎn)抬高（≥0.2 mV），提示心肌梗死造模成功；假手術(shù)組僅在相應(yīng)部位穿線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。排除胸腔內(nèi)氣體和殘留積血，逐層關(guān)胸、恢復(fù)自主呼吸拔除氣管插管，術(shù)后注射抗生素預(yù)防感染。

1.4 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組，積雪草苷低、中、高劑量組，?；撬峤M，每組均18只。造模完成24 h后，假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃等量0.9%氯化鈉注射液，各組用飲用水溶解藥物，積雪草苷低、中、高劑量組分別灌胃給藥1.62、3.24、6.48 mg/（kg·d），牛磺酸組灌胃?；撬崴幰?00 mg/（kg·d），每天早晚各1次，治療4周［5］。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）TTC染色觀察大鼠心肌梗死面積。治療4周后，每組隨機(jī)選取6只大鼠稱質(zhì)量，麻醉并開胸取心臟，冰生理鹽水沖洗并用濾紙吸干多余水分，左心室稱質(zhì)量，計(jì)算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量的比值。心肌組織切為5片，置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中，避光浸染30 min，每5分鐘翻動(dòng)1次；4%多聚甲醛中固定20 h，吸干組織表面清水，采用IPP圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算大鼠心肌梗死面積百分比。紅色為正常心肌，白色為心肌梗死區(qū)。2）HE染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)變化。治療4周后，麻醉大鼠取心臟，4%多聚甲醛固定制備石蠟切片；常規(guī)二甲苯脫水；蘇木精染色10 min，流水沖洗；鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗；伊紅復(fù)染30 s，梯度乙醇脫水2 min，石炭酸二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察切片。3）TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。制備心肌組織石蠟切片，參照TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)；心肌組織切片經(jīng)Proteinase處理15～30 min，PBS漂洗；實(shí)驗(yàn)組加TUNEL反應(yīng)混合液（50 μL TaT酶+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻）50 μL，陽(yáng)性對(duì)照不加TaT酶，室溫反應(yīng)60 min，PBS清洗3次，加入DAB、20%甘油緩沖液封片；滴加1滴PBS熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，每張切片計(jì)算5個(gè)不同視野，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。4）Western blotting檢測(cè)心肌組織蛋白表達(dá)。適量心肌組織，RIPA裂解液裂解組織，勻漿組織樣品，冰上裂解，提取總蛋白；BCA法測(cè)定蛋白濃度；變性蛋白50 μg進(jìn)行SDSPAGE，濃縮膠（5%）電壓80 V，分離膠（10%）電壓120 V，電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；5%脫脂奶室溫封閉1 h，一抗（GRP78、PERK、CHOP、Bax、Bcl-2、Caspase-12）1∶500稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次；二抗1∶5000稀釋，室溫1 h，TBST清洗3次；ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍照，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，再次采用SNK-q或LSD-t進(jìn)行兩兩比較；計(jì)數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠基本情況 假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡情況，造模過(guò)程中因麻醉、24 h急性心力衰竭、氣胸等原因死亡的大鼠20只，術(shù)后24 h存活率為81.48%。模型組術(shù)后第8天死亡1只，積雪草苷低劑量組第12天死亡1只。術(shù)后4周，假手術(shù)組大鼠18只，積雪草苷中、高劑量組、?；撬峤M大鼠各14只，模型組、積雪草苷低劑量組大鼠13只。

2.2 各組大鼠左室質(zhì)量、體質(zhì)量、左室梗死面積比較見表1，圖1。各組大鼠，體質(zhì)量比較無(wú)顯著差異；與假手術(shù)組比較，模型組左室質(zhì)量和左室質(zhì)量/體質(zhì)量的比值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，不同劑量積雪草苷和?；撬嶂委熀?，左室質(zhì)量、左室質(zhì)量/體質(zhì)量和左室梗死面積的比值顯著下降（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，不同劑量積雪草苷組和?；撬峤M治療后，梗死面積均明顯下降（P＜0.05），提示積雪草苷和牛磺酸可發(fā)揮減少心肌梗死面積，保護(hù)心肌的作用。

表1 各組大鼠左室質(zhì)量、體質(zhì)量、左室梗死面積比較（±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與積雪草苷低劑量組比較，#P＜0.05；與積雪草苷中劑量組比較，▲P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組牛磺酸組n 6 6 6 6 6 6左室質(zhì)量（mg）512.31±42.34724.92±60.17*654.14±54.23*△574.37±50.65*△#525.46±46.29△521.37±44.54△#▲體質(zhì)量（g）226.04±15.12223.07±14.51227.10±12.19231.20±13.45230.07±14.21228.02±12.54左室質(zhì)量/體質(zhì)量（mg/g）2.27±0.543.25±0.65*2.46±0.57*△2.35±0.48△2.31±0.43#2.29±0.49左室梗死面積（%）—45.68±6.8437.16±6.12△23.55±5.26△#13.67±5.07△#▲10.81±5.18△#▲

圖1 TTC染色觀察心肌梗死

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)比較 見表2，圖2。TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞，陽(yáng)性核仁計(jì)數(shù)結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組凋亡細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，積雪草苷各組和?；撬峤M細(xì)胞凋亡比例顯著減少（P＜0.05），提示積雪草苷和?；撬峥蓽p少心肌細(xì)胞凋亡比例。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)比較（%，±s）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)比較（%，±s）

組別假手術(shù)組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組牛磺酸組n666666心肌細(xì)胞凋亡2.17±0.0440.12±5.23*31.46±5.67*△#▲25.37±3.16*△#18.06±2.79*△#▲15.73±2.10*△#▲

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，200倍）

2.4 各組心肌細(xì)胞形態(tài)比較 見圖3。HE染色顯示假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，分布均勻，無(wú)水腫或壞死；模型組心肌纖維不規(guī)則，橫紋不清或缺失，大面積心肌壞死，間質(zhì)水腫伴中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；積雪草苷低、中、高劑量組和牛磺酸組心肌纖維輕度擴(kuò)張，心肌纖維局灶性丟失，未見心肌壞死。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)（HE染色，200倍）

2.5 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達(dá)比較 見圖4，表3。Western blotting檢測(cè)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組GRP78、PERK、CHOP蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，積雪草苷各組和?；撬峤MGRP78、PERK、CHOP蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而積雪草高劑量組與牛磺酸組PERK、CHOP蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異。積雪草各組呈劑量依賴性降低。

圖4 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達(dá)

表3 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達(dá)（±s）

表3 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、PERK、CHOP蛋白表達(dá)（±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與積雪草苷低劑量組比較，#P＜0.05；與積雪草苷中劑量組比較，▲P＜0.05；與積雪草苷高劑量組比較，☆P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組?；撬峤Mn 6 6 6 6 6 6 GRP780.17±0.020.84±0.05*0.71±0.06*△0.52±0.04*△#0.34±0.05*△#▲0.19±0.02△#▲☆PERK 0.16±0.010.87±0.08*0.66±0.07*△0.41±0.03*△#0.18±0.02△#▲0.17±0.01△#▲CHOP 0.17±0.010.63±0.06*0.40±0.04*△0.31±0.02*△#0.17±0.02△#▲0.16±0.01△#▲

2.6 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 見圖5，表4。Western blotting檢測(cè)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Bax、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，積雪草苷各組隨劑量的升高Bax、Caspase-12、Caspase-3蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白升高（P＜0.05），均呈劑量依賴性，且積雪草苷高劑量組與牛磺酸組蛋白無(wú)顯著差異。

圖5 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)

表4 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)（±s）

表4 各組凋亡蛋白Bax和Bcl-2、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)（±s）

組別n Bax Caspase-12Caspase-3Bcl-2假手術(shù)組模型組積雪草苷低劑量組積雪草苷中劑量組積雪草苷高劑量組?；撬峤M6 6 6 6 6 60.18±0.020.75±0.04*0.61±0.10*△0.48±0.05*△#0.20±0.06△#▲0.18±0.03△#▲0.17±0.010.77±0.07*0.69±0.03*△0.40±0.03*△#0.18±0.12△#▲0.17±0.01△#▲0.47±0.060.80±0.05*0.69±0.06*△0.38±0.04*△#0.19±0.02*△#▲0.19±0.03*△#▲0.48±0.050.16±0.02*0.20±0.03*△0.26±0.04*△#0.39±0.03*△#▲0.43±0.03△#▲

3 討論

積雪草屬于傘形科植物，主要含有三萜皂苷類物質(zhì)，是多版《中國(guó)藥典》的收藏品種。研究證實(shí)，積雪草對(duì)熱證、癰疽、皮膚創(chuàng)傷、瘢痕的治療效果良好［7］。AC是積雪草三萜皂苷類的重要成分，研究顯示，AC具有抗炎作用，可保護(hù)大鼠原代心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷［8］。AC對(duì)人成纖維細(xì)胞具有明顯的增殖促進(jìn)作用。AC在心梗大鼠中具有明顯的抗炎、抗纖維化作用，可抑制非梗死區(qū)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，減輕心肌梗死后心肌纖維化［5］。研究顯示，AC處理后，急性心肌梗死大鼠左心室功能得到顯著改善［9］。目前關(guān)于AC對(duì)AMI大鼠保護(hù)作用的通路研究則較少，本研究通過(guò)構(gòu)建急性心肌梗死大鼠模型，探究AC對(duì)AMI大鼠心肌保護(hù)作用。根據(jù)結(jié)扎后大鼠肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖J點(diǎn)抬高，提示造模成功。本研究中，與假手術(shù)組比較，模型組左室質(zhì)量和左室質(zhì)量/體質(zhì)量的比值顯著增加，心肌梗死面積著增加，心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加；AC干預(yù)后，大鼠左室質(zhì)量和左室質(zhì)量/體質(zhì)量的比值，梗死面積、細(xì)胞凋亡比例顯著減少，HE染色顯示，模型組心肌纖維不規(guī)則，橫紋不清或缺失，積雪草苷各組和牛磺酸組心肌纖維輕度擴(kuò)張，心肌纖維局灶性丟失。提示AC對(duì)模型大鼠心肌組織具有保護(hù)作用，是治療心肌梗死的潛在藥物。

近年來(lái)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，ERS與AMI后心室重建引起的細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)控蛋白折疊與Ca2+穩(wěn)態(tài)重要的細(xì)胞器，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺氧、缺糖、缺血、大量自由基堆積、Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等應(yīng)激情況時(shí)均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。UPR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記分子，應(yīng)激條件下，ERS和GRP發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，應(yīng)激過(guò)度，應(yīng)激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)通路GRP78/PERK/CHOP，PEPK誘導(dǎo)CHOP表達(dá)增加，激活Caspase-12促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。心肌肥大心力衰竭大鼠模型中，GRP78、CHOP表達(dá)顯著增加［12］。小豬左冠狀動(dòng)脈前降支放置收縮環(huán)，導(dǎo)致小豬心力衰竭，誘導(dǎo)ERS相關(guān)的CHOP、Caspase-12凋亡通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡［13］。研究報(bào)道，低糖可促進(jìn)大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活，促進(jìn)GRP78、PERK、CHOP通路蛋白表達(dá)增加［14］。本研究顯示，AMI組GRP78、PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平顯著升高，AC處理后，積雪草苷各組GRP78、PERK、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)降低，提示心肌梗死促進(jìn)GRP78-PERK-CHOP的激活，AC抑制GRP78-PERK-CHOP的激活，這表明AC可通過(guò)抑制ERS通路抑制細(xì)胞凋亡。

研究顯示，CHOP凋亡通路與線粒體凋亡通路密切相關(guān)，CHOP可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，引起促凋亡蛋白Bax易位到線粒體，發(fā)揮促凋亡作用［15］。研究報(bào)道，CHOP通過(guò)激活Caspase-12進(jìn)而激活下游Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)，促進(jìn)Capase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)損傷［16］。本研究顯示，AMI大鼠Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，AC處理后，積雪草苷各組和Tau組Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白升高，提示AC可抑制細(xì)胞的凋亡以發(fā)揮其對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，AC可以減少心肌梗死面積，降低凋亡細(xì)胞數(shù)量，改善心肌組織病理變化，其可能是通過(guò)抑制GRP78/PERK/CHOP通路的激活，抑制凋亡相關(guān)通路，發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。