可手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者外周靜脈血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度的臨床價值研究

賈殿軍 王利軍 程險峰

摘要：目的? 探討定量檢測可手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者外周血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度的臨床價值。方法? 選擇2017年1月～12月承德市中心醫(yī)院胸外科60例可手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者為實驗組，分別于手術(shù)前1 d、手術(shù)后7 d、手術(shù)后20 d采集外周靜脈血液標(biāo)本，同期于承德市中心醫(yī)院體檢中心選擇60例健康體檢者為對照組，采集外周靜脈血液標(biāo)本，定量檢測兩組標(biāo)本血液中cfDNA總濃度及長片段DNA濃度，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果? 實驗組患者手術(shù)前1 d外周靜脈血中cfDNA總濃度較對照組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;實驗組患者術(shù)后7 d外周靜脈血中cfDNA總濃度較術(shù)前1 d無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;實驗組患者術(shù)后20 d外周靜脈血中cfDNA總濃度較術(shù)前1 d、術(shù)后7 d降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組患者手術(shù)前1 d外周靜脈血中長片段DNA濃度高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;實驗組患者術(shù)后7 d外周靜脈血中長片段DNA濃度較術(shù)前1 d無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;實驗組患者術(shù)后20 d外周靜脈血中長片段DNA濃度較術(shù)前1 d、術(shù)后7 d降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 外周靜脈血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度可間接反映非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤負(fù)荷狀況，有望成為非小細(xì)胞肺癌輔助診斷、療效評估及預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌;外周血cfDNA總濃度;長片段DNA濃度

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.030

文章編號：1006-1959（2019）04-0091-04

Abstract：Objective? To investigate the clinical value of quantitative detection of total cfDNA concentration and long DNA concentration in peripheral blood of patients with operable non-small cell lung cancer. Methods? From January to December 2017， 60 patients with operable non-small cell lung cancer in the Department of Thoracic Surgery， Chengde Central Hospital were selected as experimental group. Peripheral venous blood samples were collected 1 d before surgery， 7 d after surgery and 20 d after surgery. In the same period， 60 healthy people in the physical examination center of Chengde Central Hospital were selected as the control group. Peripheral venous blood samples were collected， and the total concentration of cfDNA and long DNA concentration in the blood of the two groups were quantitatively analyzed for statistical analysis. Results? The total concentration of cfDNA in peripheral vein blood in the experimental group was significantly higher than that in the control group one day before operation，the difference was statistically significant （P<0.05），There was no significant change in the total concentration of cfDNA in the peripheral venous blood of the patients in the experimental group at 7 d after operation compared with that in the first day before operation （P>0.05），the total concentration of cfDNA in the peripheral venous blood of the patients in the experimental group was significantly lower than that in the first day of operation and 7 d after operation （P<0.05） at the 20th d after operation，The concentration of long fragment DNA in peripheral venous blood of the experimental group was higher than that of the control group 1 d before operation，the difference was statistically significant （P<0.05）.There was no significant difference in the concentration of long-segment DNA in peripheral blood of the experimental group on the 7th d after operation （P>0.05）. The long-term DNA concentration in the peripheral venous blood of the experimental group was 20 d after operation. Compared with 1 d before surgery and 7 d? after operation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? The total concentration of cfDNA and long-segment DNA concentration in peripheral venous blood can indirectly reflect the tumor burden of non-small cell lung cancer patients， and it is expected to be a reference index for auxiliary diagnosis， efficacy evaluation and prognosis of non-small cell lung cancer.

Key words：Non-small cell lung cancer;Total concentration of peripheral blood cfDNA;Long fragment DNA concentration

肺癌（lung cancer）已成為惡性腫瘤相關(guān)死亡的首要原因[1]，在我國公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)中：2015年肺癌發(fā)病率及死亡率均位居惡性腫瘤首位[2]，其中非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的80%。外周靜脈血cfDNA是指游離于人體靜脈血液中的脫氧核糖核苷酸，目前已證實在健康人的血液中，cfDNA主要來自凋亡細(xì)胞，幾乎不來自壞死細(xì)胞[3]，而腫瘤患者血液中的cfDNA只有小部分來自于凋亡細(xì)胞，而絕大部分來自于腫瘤細(xì)胞主動釋放的DNA及腫瘤壞死溶解產(chǎn)生的DNA[4]。有實驗研究表明，惡性腫瘤患者外周靜脈血中cfDNA總濃度明顯高于健康人，長片段DNA作為cfDNA中最具有代表性的檢驗指標(biāo)，可間接反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化[5]。為此，本研究采用QPCR法定量檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周靜脈血中cfDNA總濃度及長片段DNA濃度，并與同期健康人群作對比，以探究其與非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤負(fù)荷的關(guān)系。

1資料與方法

1.1 一般資料? 選取2017年1月～12月承德市中心醫(yī)院胸外科收治的可手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌患者60例為實驗組，其中男45例，女15例，年齡45～65歲，平均年齡（56.58±3.35）歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過，所有患者自愿加入并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性肺癌，初診、初治、可手術(shù)切除且術(shù)前活檢病理考慮為非小細(xì)胞肺癌或臨床診斷為肺惡性腫瘤且經(jīng)術(shù)后病理證實的患者;②無急性炎癥、創(chuàng)傷、脫水及劇烈運(yùn)動等情況;③若手術(shù)前入實驗組手術(shù)后病理證實為小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移癌及肺部良性腫物者剔除。選擇同期于承德市中心醫(yī)院體檢中心健康體檢者60例為對照組，其中男45例，女15例，年齡45～65歲，平均年齡（54.58±2.10）歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①體檢后隨訪6個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)腫瘤或癌前病變;②無急性炎癥、創(chuàng)傷、脫水及劇烈運(yùn)動等情況。兩組的排除標(biāo)準(zhǔn)：①感染性疾病的患者;②系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的患者;③接受器官移植及血液系統(tǒng)疾病的患者;④腦出血、腦梗死、心肌梗死、肺栓塞的患者;⑤妊娠期患者;⑥術(shù)前行新輔助放療、化療、免疫治療的患者。兩組年齡、性別等基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），研究可比。

1.2儀器與方法? ①標(biāo)本的采集：用EDTA抗凝管分別采集兩組研究對象外周靜脈血液10 ml;②實驗血漿制備：將所采集標(biāo)本放入離心機(jī)（TGL-20型）中以1600 rpm離心10 min，小心吸取淡黃色血漿上清到新的離心管中再用16000 rpm離心10 min，獲得血漿樣品;③血漿直接擴(kuò)增模板準(zhǔn)備：將血漿樣品用Tris-EDTA緩沖液進(jìn)行10倍稀釋后作為血漿直接擴(kuò)增模板備用。④標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：先將Human DNA Standard（100 ng/μl）用Stock Diluent，SDB稀釋5倍至濃度為20 ng/μl的Stock，再稀釋20倍得到濃度為1.0 ng/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，再將所得的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋4倍，共稀釋6次，得到濃度由1.0 ng/μl至0.000244141 ng/μl的7個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。⑤QPCR反應(yīng)體系配制及反應(yīng)：根據(jù)所需要配制的孔數(shù)行反應(yīng)體系配制，分別配出需要量的目的片段以及內(nèi)參照Internal PCR Control（IPC）的反應(yīng)體系混合物。2 μl血漿的模板DNA、2X SYBR GREEN MASTER MIX、1 mM每種dNTP、0.2 μm引物，上述為25 μl體系，不足部分用去核酸酶水補(bǔ)齊。引物1（總濃度，human LINE-1 family，97 bp）：正向： 5'-tggcacatatacaccatggaa-3'、反向： 5'- tgagaatgatggtttccaatttc-3'[6]。引物 2（長片段濃度，human LINE-1 family，300 bp）：正向： 5'-ACACCTATTCCAAAATTGACCAC-3'、反向：5'-TTCCCTCTACACACTGCTTTGA-3'[7]。QPCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，95℃，1 min;變性， 95℃，8 s;退火/延伸 60℃，15 s;變性，退火/延伸，35個循環(huán)，進(jìn)行實時定量PCR檢測。

1.3觀察指標(biāo)? 比較實驗組術(shù)前1 d與對照組外周靜脈血中cfNDA總濃度及長片段DNA濃度情況;比較實驗組術(shù)前1 d、術(shù)后7 d、術(shù)后20 d外周靜脈血中cfNDA總濃度及長片段DNA濃度變化情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析? 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗檢測結(jié)果進(jìn)行分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗，實驗組手術(shù)前后不同時間段數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組外周靜脈血中cfNDA總濃度比較? 實驗組患者術(shù)前1 d外周靜脈血中cfDNA總濃度高于對照組（t=9.519，P=0.000），實驗組患者術(shù)后7 d外周靜脈血中cfDNA總濃度較術(shù)前1 d無明顯變化（t=0.161，P=0.873），實驗組患者術(shù)后20 d外周靜脈血中cfDNA總濃度較術(shù)前1 d、術(shù)后7 d下降（t=2.594，P=0.012;t=2.668，P=0.010），見表1。

2.2兩組血漿長片段DNA濃度比較? 實驗組患者術(shù)前1 d外周靜脈血中長片段DNA濃度高于對照組（t=9.366，P=0.000），實驗組患者術(shù)后7 d外周靜脈血中長片段DNA濃度與術(shù)前1 d無明顯變化（t=0.546，P=0.587），實驗組患者術(shù)后20 d外周靜脈血中長片段DNA濃度較術(shù)前1 d、術(shù)后7 d下降（t=2.280，P=0.026;t=2.964，P=0.004），見表2。

3討論

目前，非小細(xì)胞肺癌的臨床常用輔助診斷方法主要有胸部CT、纖維支氣管鏡及血清腫瘤標(biāo)記物等，胸部CT可顯示病變的大小、范圍及縱隔淋巴結(jié)等情況[8]，但受到掃描層厚的影響，一般很難發(fā)現(xiàn)直徑<5 mm的腫瘤，且有輻射暴露。纖維支氣管鏡+組織病理學(xué)活檢技術(shù)是診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，但前者對周圍型肺癌的診斷率較低，有部分患者難以耐受。血清腫瘤標(biāo)記物在惡性腫瘤患者的組織、體液中廣泛存在[10，11]，與肺癌相關(guān)的主要有細(xì)胞角蛋白21-1（CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）以及癌胚抗原（CEA）[12]等，該檢測具有創(chuàng)傷小、便捷、迅速等特點(diǎn)，但單個標(biāo)記物的敏感性和特異性偏低，較難滿足臨床的需求，因此常常將幾種腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測，即使這樣其敏感性和特異性仍不夠理想。

在腫瘤診療過程中，對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷量的大小及變化進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測具有臨床意義。美國國家癌癥研究所（NCI）給出了腫瘤負(fù)荷（tumor burden，TB）的定義，即人體中癌細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤的大小或癌癥病灶的總量。有研究表明，外周靜脈血中的游離DNA（cfDNA）和長片段DNA濃度可間接反映人體內(nèi)TB的變化，且特異性和靈敏性較高、侵入性小、便捷、經(jīng)濟(jì)，可以對TB進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測進(jìn)而反映腫瘤的生物活性[13]。

健康人外周血游離DNA大多來源于體細(xì)胞正常的新陳代謝，而腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細(xì)胞，且健康人外周血游離DNA的含量較腫瘤患者的外周血游離DNA的含量低[14]。目前，國內(nèi)外已有大量研究結(jié)果表明外周靜脈血cfDNA總濃度與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性[15]，腫瘤患者cfDNA水平高于正常人，且cfDNA具有ctDNA的特征，如腫瘤相關(guān)基因的突變、微衛(wèi)星改變、甲基化異常及線粒體DNA突變等[16]。已有研究表明，在直腸癌患者中，其外周血cfDNA聯(lián)合血清腫瘤標(biāo)志物檢測，可提高直腸癌診斷的敏感性和特異性 [17，18]。對于胃癌患者，外周血cfDNA聯(lián)合腫瘤標(biāo)記物，可提高胃癌的診斷率，且二者聯(lián)合對胃癌篩選具有臨床應(yīng)用價值[19]。宮頸癌患者外周血cfDNA濃度與患者臨床分期的早晚、病理分級的高低、腫瘤直徑的大小、血清腫瘤標(biāo)記物的升高或下降趨勢呈正相關(guān)，血清cfDNA水平過高則表明宮頸癌進(jìn)展或預(yù)后不良[20，21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周靜脈血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度的在非小細(xì)胞肺癌患者與健康人之間存在差異，動態(tài)監(jiān)測可反映其體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化，臨床上可用于輔助非小細(xì)胞肺癌患者的診斷、治療效果的評估及腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測。非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)前呈帶瘤狀態(tài)，外周血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度高于健康人，手術(shù)切除肉眼可見腫瘤后外周血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度均下降;術(shù)后7 d由于機(jī)體仍處于手術(shù)應(yīng)激狀態(tài)或手術(shù)后的創(chuàng)傷恢復(fù)期，此時檢測外周靜脈血中cfDNA總濃度及長片段DNA濃度并不能準(zhǔn)確的反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化，因為這一時期存在多項干擾因素，而術(shù)后20 d機(jī)體逐漸恢復(fù)，內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)態(tài)，此時檢測外周靜脈血中cfDNA總濃度及長片段DNA濃度受其它因素影響較小，可準(zhǔn)確的反映體內(nèi)腫瘤負(fù)荷的變化，用于評價治療效果。

綜上所述，外周血cfDNA總濃度及長片段DNA濃度在非小細(xì)胞肺癌患者輔助診斷、評估療效、監(jiān)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后等方面存在一定的臨床意義，有進(jìn)一步研究的價值。

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收稿日期：2018-11-23;修回日期：2018-12-6

編輯/成森