骨碎補(bǔ)對(duì)牙周炎大鼠正畸牙移動(dòng)保持階段RANKL表達(dá)影響的研究

宋佳 趙剛 宋春蕾

摘要：目的? 研究牙周炎的大鼠牙齒移動(dòng)保持階段，中藥骨碎補(bǔ)對(duì)牙槽骨成骨作用以及對(duì)RANKL表達(dá)影響的研究。方法? 將45只雄性Wister大鼠建立牙周炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成9個(gè)組，每組5只，進(jìn)行標(biāo)記。其中1組設(shè)為空白組，4組對(duì)照組，4組實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M拉簧牽拉上頜左側(cè)第一磨牙向近中移動(dòng)，牽拉21 d后分別在保持3，7，14，21 d處死;實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別建立牙移動(dòng)模型，實(shí)驗(yàn)組在保持階段的3，7，14，21 d的前1天灌服骨碎補(bǔ)水煎液0.9 g/kg， 1次/d;對(duì)照組同樣時(shí)間灌服等量0.9%氯化鈉溶液，1次/d。HE染色觀察成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。免疫組織化學(xué)切片觀察RANKL因子表達(dá)量。結(jié)果? 實(shí)驗(yàn)組的RANKL表達(dá)量在初期先增加，從第7 d開始RANKL表達(dá)量開始逐漸降低。同一節(jié)點(diǎn)對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組RANKL表達(dá)量低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組在保持第21 d RANKL表達(dá)量非常少，牙周膜處于穩(wěn)定狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 骨碎補(bǔ)水煎液可以促進(jìn)成骨，穩(wěn)定牙槽骨及牙周膜的改建，降低RANKL的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：骨碎補(bǔ);牙周炎;牙移動(dòng);RANKL

中圖分類號(hào)：R781.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.028

文章編號(hào)：1006-1959（2019）04-0085-03

Abstract：Objective? To study the effect of Chinese medicine granules on the alveolar bone osteogenesis and the expression of RANKL in periodontitis rats. Methods? 45 male Wister rats were established experimental models of periodontitis. Rats were divided into 9 groups according to the random number table method， and 5 rats in each group were labeled. One group was set as blank group， 4 groups were control group， and 4 groups were experimental group. The blank group was pulled to pull the first molar on the left side of the upper jaw and moved to the middle. After 21 d of pulling， the rats were sacrificed for 3， 7， 14 and 21 d.The tooth movement model was established in the experimental group and the control group respectively.The experimental group was given 0.9 g/kg of decoction of bone decoction once a day， 3， 7， 14， 21 d of the maintenance phase， once a day;The control group was given the same amount of 0.9% sodium chloride solution once a day for the same time. Osteoblasts were observed by HE staining. Immunohistochemical sections were used to observe the expression level of RANKL factor. Results? The expression level of RANKL in the experimental group increased first， and the expression level of RANKL began to decrease gradually from the 7th day. Compared with the same node， the expression level of RANKL in the experimental group was lower than that in the control group. In the experimental group， the expression of RANKL was very low at 21 d and the periodontal ligament was stable，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? Wound decoction can promote osteogenesis， stabilize the alveolar bone and periodontal ligament， and reduce the expression of RANKL.

Key words：Orthodontic;Periodontitis;Tooth movement;RANKL

口腔正畸治療牙周病可以減輕患牙松動(dòng)度、改善病患的出血情況，降低病患牙周袋深度[1]。但是正畸牙移動(dòng)后，牙周膜纖維組織改建較慢并有恢復(fù)趨勢(shì)，很容易使牙齒發(fā)生移動(dòng)。目前對(duì)牙周病正畸治療后保持階段研究較少。中藥骨碎補(bǔ)具有強(qiáng)骨、止痛的功效?，F(xiàn)已被制成多種制劑用于牙齒松動(dòng)、跌撲閃挫、筋骨折傷[2]。轉(zhuǎn)錄因子NF-KB受體活化劑配體（receptor activator of NF-kB ligand，RANKL）是參與骨改建的重要細(xì)胞因子之一。成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)RANKL和OPG，都能與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，RANKL與破骨細(xì)胞細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟，并且抑制破骨細(xì)胞的凋亡[3]。本研究通過(guò)給患有牙周炎正畸牙移動(dòng)保持階段的大鼠灌服水煎骨碎補(bǔ)中藥，用免疫組化檢測(cè)RANKL因子的表達(dá)，探討中藥骨碎補(bǔ)在牙周炎正畸牙移動(dòng)后保持階段對(duì)牙周膜及牙槽骨的改建作用，為縮短牙周炎正畸患者保持時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料? 每2000 ml 水中加 20 g 骨碎補(bǔ)（購(gòu)于黑龍江省佳木斯中醫(yī)院）浸泡 30 min，加熱至沸騰半個(gè)小時(shí)后濾渣，將濾液濃縮至 200 ml，即制成 100% 濃度的水煎劑。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 選擇清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，體重（180～220 g）45只[購(gòu)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK（黑）2013-001]，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》飼養(yǎng)，消毒，清理，喂養(yǎng)無(wú)菌飼料（由佳木斯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），飼養(yǎng)1周后開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3方法

1.3.1分組? 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成9個(gè)組，每組5只，進(jìn)行標(biāo)記。其中1組設(shè)為空白組，4組對(duì)照組，4組實(shí)驗(yàn)組。牙周炎組建立牙周炎模型，注射過(guò)量10%的水合氯醛處死，HE染色及免疫組化染色。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組建立牙周炎及正畸牙移動(dòng)模型，實(shí)驗(yàn)組灌服骨碎補(bǔ)水煎液，對(duì)照組灌服等量的0.9%氯化鈉溶液。分別在第3，7，14，21 d處死，HE染色及免疫組化染色。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立? 牙周炎動(dòng)物模型建立：用10%水合氯醛3.5 ml/kg（100 ml，雷根生物供應(yīng)室，實(shí)驗(yàn)使用），腹腔麻醉，仰臥位固定，上開口器（用0.9 mm不銹鋼彎制），用探針（口腔器械盒，保定市醫(yī)療器械有限公司）將大鼠上頜左側(cè)第一磨牙牙齦剝離。在大鼠上頜左側(cè)第一磨牙近中牙頸部齦溝處用快速手機(jī)（402高速手機(jī)，順遜醫(yī)療器械）磨0.2 mm深固位溝，選用0.20 mm結(jié)扎絲（杭州奧索醫(yī)療器械有限公司）將大鼠上頜左側(cè)第一磨牙結(jié)扎（盡量結(jié)扎到牙齦溝處）。給大鼠喂養(yǎng)高糖水（100 g/L），將飼料（佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）泡軟，為期1個(gè)月。1個(gè)月觀察可見上頜第一磨牙牙齦紅腫、探診出血、牙周袋，即牙周炎動(dòng)物模型建立成功。

正畸牙移動(dòng)模型建立：將大鼠麻醉，固定，大鼠上頜兩顆中切牙頸部的遠(yuǎn)中面磨出深0.2 mm的固位溝，拉簧（鎳鈦合金牙齒矯形拉簧，北京圣瑪科技有限公司）一側(cè)連接大鼠磨牙，另一側(cè)與大鼠切牙連接。測(cè)力計(jì)（杭州奧索牙用測(cè)力計(jì)桿式測(cè)力計(jì)，50/格）測(cè)拉力約50 g，加力21 d。建立保持期模型，用結(jié)扎絲連扎大鼠第一磨牙及切牙，保持第一磨牙移動(dòng)后位置。在加力裝置去除前1 d開始灌服。實(shí)驗(yàn)組灌服骨碎補(bǔ)水煎液（中醫(yī)院購(gòu)買，制備成0.9 g/kg溶液），對(duì)照組灌服等量的0.9%氯化鈉溶液。分別在3，7，14，21 d處死大鼠。

1.3.3免疫組化及HE染色? 取大鼠左側(cè)上頜骨，在4%多聚甲醛固定液（北京華越洋生物科技有限公司）固定24 h。在EDTA溶液中4℃脫鈣50 d。PBS沖洗干凈、石蠟包埋，與牙體長(zhǎng)軸平行切片，取牙齒近遠(yuǎn)中組織切片免疫組化。①HE染色：烤片，二甲苯脫蠟25 min，蘇木素侵泡3 min染色，淡氨水反藍(lán)，沖洗，0.5%伊紅侵泡2 min，沖洗，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。②免疫組化染色：烤片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，室溫下使用復(fù)合酶消化液，滴加抗原修復(fù)液I，充分暴露抗原，用3%過(guò)氧化氫孵育以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加二抗，DAB溶液顯色，電鏡下觀察抗原抗體，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

1.4評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)? RANKL表達(dá)量用平均光密度值，每個(gè)組織切片隨機(jī)分析片子上、中、下三個(gè)不同部位的高倍鏡視野，測(cè)量其平均值，測(cè)量值越大，RANKL表達(dá)越多。觀察免疫組化切片可見，RANKL的陽(yáng)性表達(dá)集中在大鼠牙槽骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，胞膜、胞質(zhì)及核膜都被染色，呈棕黃色顆粒狀[4]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 使用GraphPad prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采取多因素方差方法分析比較時(shí)間和藥物因素對(duì)RANKL表達(dá)的影響，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果? 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统跗?，可見牙周膜纖維界限模糊不清，牙周纖維拉長(zhǎng)。在第3天時(shí)可見破骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞團(tuán)，牙根處牙周膜內(nèi)可見成骨細(xì)胞（圖1A、1B），實(shí)驗(yàn)組牙周纖維排列規(guī)律，而對(duì)照組牙周纖維紊亂，但差異不明顯。在第7天開始到第21天，牙周膜寬度逐漸縮小，纖維排列穩(wěn)定，出現(xiàn)大量的成骨樣細(xì)胞。對(duì)照組牙周纖維比較紊亂，存在成骨細(xì)胞的同時(shí)也存在大量的破骨樣細(xì)胞。在保持的第21天，實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)胞大部分處于穩(wěn)定的狀態(tài)且看到成骨細(xì)胞（圖1D），對(duì)照組牙周膜細(xì)胞排列紊亂（圖1C）。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果? RANKL因子主要表達(dá)在牙周膜及牙槽骨的細(xì)胞膜及細(xì)胞漿等部位，陽(yáng)性的表達(dá)結(jié)果變現(xiàn)為黃色或黃棕色，淡藍(lán)色為陰性表達(dá)，白色是底色。在保持開始到第7 d，可見RANKL因子大量表達(dá)（圖2E、F）。隨著保持時(shí)間延長(zhǎng)，可見RANKL因子表達(dá)量逐漸降低，并且出現(xiàn)陰性表達(dá)。在保持第21 d對(duì)照組可見吸收陷窩（圖G），第21 d實(shí)驗(yàn)組RANKL因子表達(dá)量微乎其微并出現(xiàn)大部分淡藍(lán)色陰性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1、圖H。

3討論

牙周炎是牙齦炎未得到及時(shí)治療，導(dǎo)致炎癥由牙齦向深層擴(kuò)散到牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)而發(fā)展引起的牙周組織的慢性炎癥，嚴(yán)重時(shí)牙齒將不能保留[5]。近年來(lái)有學(xué)者[6]將正畸治療導(dǎo)入牙周病的綜合治療系列，即在牙周炎癥控制的基礎(chǔ)上，通過(guò)完善的正畸治療排齊牙列，恢復(fù)正常鄰接關(guān)系，咀嚼功能。因此從正畸學(xué)角度來(lái)說(shuō)，需要考慮牙周炎患者正畸治療結(jié)束后的保持。目前，物理方法保持有：Hawley保持器、壓膜式透明保持器、固定式舌側(cè)保持器是臨床中3種常用[7]。有研究應(yīng)用一些強(qiáng)筋壯骨的中藥可以促進(jìn)成骨，促進(jìn)正畸牙移動(dòng)后的穩(wěn)定，如仙靈骨葆可以抑制成年大鼠牙移動(dòng)保持階段破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成[8]。

中藥骨碎補(bǔ)的主要成分為：木栓，β-香樹脂醇，β-谷甾醇等[9]。研究表明，骨碎補(bǔ)及有效成分通過(guò)提高BMP-2 蛋白和抑制 RANKL 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化和抑制破骨細(xì)胞活性的作用[10]。此外骨碎補(bǔ)有骨細(xì)胞保護(hù)作用、抗骨質(zhì)酥松作用等[11]。陳莉麗等[12]發(fā)現(xiàn)在豚鼠牙齒畸形模型中，骨碎補(bǔ)能顯著改善齒骨密度，使牙齒堅(jiān)硬度增強(qiáng)，促進(jìn)牙骨細(xì)胞的進(jìn)一步合成。許彥枝等[13]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)作用的人牙齦成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)分泌功能活躍、礦化能力增強(qiáng)。RANKL可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，增強(qiáng)成熟破骨細(xì)胞的活力，阻止破骨細(xì)胞凋亡，是破骨細(xì)胞分化成熟和維持功能所需的重要因子[14]。當(dāng)RANKL表達(dá)量增加，破骨細(xì)胞分化激活成熟，牙周膜改建中。當(dāng)RANKL表達(dá)量降低，破骨細(xì)胞分化受到抑制，停止骨吸收。

本研究中在保持階段初期，牙周膜不穩(wěn)定，RANKL表達(dá)量出現(xiàn)增加現(xiàn)象。隨著保持時(shí)間的延長(zhǎng)，牙周膜開始穩(wěn)定于新的位置，RANKL表達(dá)量逐漸降低。灌服中藥骨碎補(bǔ)水煎液的實(shí)驗(yàn)組RANKL因子降低快且大。在保持階段第21 d，實(shí)驗(yàn)組RANKL表達(dá)量降低接近于空白組，但比空白組RANKL表達(dá)量略高。說(shuō)明中藥骨碎補(bǔ)對(duì)RANKL表達(dá)有抑制作用，促進(jìn)骨改建成骨，促進(jìn)牙周膜穩(wěn)定。

綜上所述，中藥骨碎補(bǔ)對(duì)牙周膜改建有促進(jìn)作用，抑制破骨RANKL因子的表達(dá)。若中藥骨碎補(bǔ)應(yīng)用于臨床可減少牙周炎患者物理保持的時(shí)間，從而達(dá)到更好的治療效果，及提高穩(wěn)定性。

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收稿日期：2018-10-30;修回日期：2018-11-20

編輯/肖婷婷