TRFIA法檢測(cè)HBV表面抗原最佳臨界值及灰區(qū)探討

葉 莎,魏 娜

(1.巴音郭楞蒙古自治州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆庫爾勒 841000;2.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100089)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種全球性的流行病，而其是我國感染人數(shù)最多、流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的病毒性肝炎之一。HBV感染最先出現(xiàn)的標(biāo)志物是HBV表面抗原[1]，因此，HBV表面抗原的檢出有利于乙型肝炎的早期診斷、治療及預(yù)防傳播。HBV表面抗原常用的檢測(cè)方法是 ELISA 方法,但由于ELISA法檢測(cè)影響因素較多，近幾年實(shí)驗(yàn)室逐漸開展時(shí)間分辨熒光免疫試驗(yàn)(TRFIA)檢測(cè)HBV表面抗原,其原理是采用雙抗體夾心時(shí)間分辨熒光分析法，以單克隆抗體包被反應(yīng)板，鑭系元素Eu3+標(biāo)記抗體，并與時(shí)間分辨測(cè)定技術(shù)相結(jié)合建立起來的一種新型非放射性微量分析技術(shù)[2]。該方法具體靈敏度高、發(fā)光穩(wěn)定、壽命延長、自然熒光干擾少等優(yōu)點(diǎn)[3]。HBV表面抗原定量試劑已由最初的一代試劑發(fā)展為二代試劑，其檢測(cè)的敏感性顯著的提高，同時(shí)假陽性率是否會(huì)增高？各廠家試劑產(chǎn)品說明書提供的臨界值不盡相同，同時(shí)試劑廠家所使用的定值參考人群也不同[4]，因此，需要對(duì)臨界值進(jìn)行設(shè)定。此外，在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)廠家給定的臨界值(0.05 IU/mL)判斷檢驗(yàn)結(jié)果，易出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致部分患者的誤診，會(huì)引起患者及家屬的恐慌，造成巨大的負(fù)面影響。由于TRFIA法靈敏度高，從而有一部標(biāo)本呈現(xiàn)弱陽性，即灰區(qū)。研究報(bào)告[5-6 ]指出灰區(qū)的標(biāo)本容易漏診或誤診。目前，關(guān)于TRFIA檢測(cè)乙肝表面抗原臨界值及灰區(qū)鮮見報(bào)道，因此，本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)條件，探討TRFIA法檢測(cè)乙肝表面抗原的最佳臨界值及灰區(qū)，制定適合本實(shí)驗(yàn)室最佳臨界值和灰區(qū)，為臨床乙型肝炎病毒感染的診斷提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年6月來某三甲醫(yī)院住院患者或體檢者血清或血漿經(jīng)TRFIA檢測(cè)乙肝表面抗原陽性的標(biāo)本150例和接近臨界值(陰性)標(biāo)本30例，其中定量值在0.03～<0.05 IU/mL有30例，0.05～<0.10 IU/mL有50例，0.1～<0.2 IU/mL有40例，0.2～<0.5 IU/mL有30例，0.5～1.0 IU/mL有30例。所有標(biāo)本均無任何凝集不完全、溶血、黃疸及脂血現(xiàn)象。

1.2儀器與試劑 蘇州新波EasyCuta全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀及配套HBV表面抗原診斷試劑盒，雅培Architect i2000化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析系統(tǒng)及配套HBV表面抗原診斷試劑,所有試劑均在有效期內(nèi)。每日使用兩個(gè)水平的質(zhì)控品監(jiān)測(cè)質(zhì)控情況，兩質(zhì)控品的濃度分別是0.5 IU/mL和1 IU/mL(北京康徹思坦公司生產(chǎn)),批號(hào)均是201803001。

1.3方法

1.3.1精密度的評(píng)價(jià) 批內(nèi)精密度用TRFIA檢測(cè)法對(duì)兩濃度水平的質(zhì)控品在同一批次內(nèi)平行檢測(cè)20次，記錄定量值，然后計(jì)算均值、s和CV(標(biāo)準(zhǔn)為CV不大于10%[7])。批間精密度在批內(nèi)精密度符合要求的基礎(chǔ)上，用TRFIA檢測(cè)法對(duì)兩濃度水平的質(zhì)控品連續(xù)檢測(cè)20天,每天平行檢測(cè)復(fù)孔，記錄其定量值，然后計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差(s)和變異系數(shù)(CV,標(biāo)準(zhǔn)為CV不大于10%[7])。

1.3.2TRFIA檢測(cè)HBV表面抗原 專業(yè)人員嚴(yán)格遵守Easycuta全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光分析儀操作規(guī)程進(jìn)行操作。有校準(zhǔn)品從A至F,依次為校準(zhǔn)品A:空白；校準(zhǔn)品B：0.05 IU/mL；校準(zhǔn)品C:0.20 IU/mL；校準(zhǔn)品D：2.00 IU/mL校準(zhǔn)品E：20.00 IU/mL；校準(zhǔn)品F:150.00 IU/mL。試劑說明書臨界值建議濃度為0.05 IU/mL。

1.3.3HBV表面抗原確證試驗(yàn) 采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(CMIA)進(jìn)行確認(rèn)，專業(yè)人員嚴(yán)格按照Architect i2000化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析儀操作規(guī)程進(jìn)行操作。所有標(biāo)本均檢測(cè)兩次，兩次檢測(cè)結(jié)果均≥0.05 IU/mL時(shí)為陽性；兩次結(jié)果不一致時(shí)，重復(fù)檢測(cè)一次，三次均值≥0.05 IU/mL為陽性，反之為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.4.1利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0錄入數(shù)據(jù)，TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果比較采用四格表Fisher確切概率法。繪制ROC曲線，判定最佳臨界值。利用公式臨界值±2CV[8]，計(jì)算其灰區(qū)，這里的CV為批間精密度變異系數(shù)。

1.4.2TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確認(rèn)試驗(yàn)一致性比較采用Kappa值來表示，Kappa的計(jì)算參考文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果

2.1批內(nèi)、批間精密度評(píng)價(jià) 兩濃度水平的質(zhì)控品，按照1.3.1方法檢測(cè)，批內(nèi)精密度分別為6.82%和5.26%，批間精密度分別為8.29%和7.31%，見表1。

表1 批內(nèi)、批間精密度評(píng)價(jià)

2.2TRFIA法檢測(cè)HBV抗原結(jié)果與確證試驗(yàn)比較 TRFIA檢測(cè)HBV抗原濃度在0.03～0.05 IU/mL的30陰性標(biāo)本，經(jīng)確證1例陽性(占3.3%)，29例陰性(占96.7%)；濃度在0.05～1.00 IU/mL的150例陽性標(biāo)本，經(jīng)確證132例陽性(占88.0%)，18例陰性(占12.0%)，見表2。

表2 TRFIA法檢測(cè)HBV抗原結(jié)果與確證試驗(yàn)比較

2.3TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確證試驗(yàn)一致性的比較 根據(jù)1.4.2中的公式計(jì)算，TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確證試驗(yàn)結(jié)果一致性的Kappa值為0.690，TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確證試驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.774，P=0.039)，見表3。

表3 兩種方法結(jié)果比較(n)

2.4最佳臨界值判定 利用SPSS19.0軟件繪制ROC曲線見圖1，該曲線下面積為0.924，其與ROC曲線下面積0.5比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。計(jì)算約登指數(shù),并以約登指數(shù)最大時(shí)，即0.794，其對(duì)應(yīng)的切點(diǎn)為臨界值，此時(shí)臨界值為0.074 IU/mL。

圖1 ROC曲線

2.5新臨界值下TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確證試驗(yàn)一致性的比較 根據(jù)1.4.2中的方法計(jì)算，此時(shí)的一致性Kappa值為0.814，見表4。

2.6灰區(qū)的判定 根據(jù)1.4.1中的計(jì)算公式得出，灰區(qū)(CV值取最大為10%),灰區(qū)為范圍-0.126～0.274 IU/mL。試劑說明書給定的灰區(qū)范圍為0.04～0.06，給定的臨界值為0.05 IU/mL，兩灰區(qū)上限或下限時(shí)靈敏度、特異度、假陽性率和假陰性率見表5?；覅^(qū)下限的設(shè)定是為了減少漏診率，減少假陰性的發(fā)生，而上限設(shè)定是為了減少誤診率，減少假陽性的發(fā)生。統(tǒng)計(jì)學(xué)認(rèn)為小于或等于5%為統(tǒng)計(jì)學(xué)可接受范圍，因此，灰區(qū)的下限設(shè)定應(yīng)滿足假陰性率≤5%，而上限是設(shè)定應(yīng)滿足假陽性率≤5%，從而確定灰區(qū)為0.05～0.274 IU/mL，見表5。

表4 新臨界值下兩種方法結(jié)果比較(n)

表5 灰區(qū)上限/下限時(shí)的敏感性、特異性、假陽性率和假陰性率(%)

注：-表示下限時(shí)無法計(jì)算假陽性數(shù)或上限時(shí)無法計(jì)算假陰性數(shù)

3 討論

ELISA法是檢測(cè)HBV表面抗原的常規(guī)方法,但由于整個(gè)檢測(cè)過程受外部環(huán)境、溫度、檢測(cè)人員等多種因素的影響，因此，近幾年TRFIA方法逐漸走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，替代ELISA方法。TRFIA是一種新型非放射性微量分析技術(shù)，目前已在臨床檢測(cè)中廣泛使用。本研究首先評(píng)估全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光儀的檢測(cè)系統(tǒng)的精密度能否滿足定量實(shí)驗(yàn)精密度的要求。采用濃度為0.5 IU/mL和1 IU/mL的質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，監(jiān)測(cè)兩濃度水平的批內(nèi)精密度CV分別為6.82%和5.26%，批間精密度CV分別為8.29和7.31%，均能滿足CV不大于10%的標(biāo)準(zhǔn)。

CMIA定量檢測(cè)HBV表面抗原是利用生物素標(biāo)記抗-HBs技術(shù)、親和素標(biāo)記磁性微珠包被技術(shù)及電化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合而建立的微量分析技術(shù)。該方法具有高度的靈敏度與特異性，解決低濃度的問題，檢測(cè)準(zhǔn)確率高[10-11]。本研究利用CMIA法對(duì)TRFIA方法檢測(cè)定量濃度在0.03～1.00 IU/mL的180例標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)確證133例陽性，47例陰性，TRFIA法檢測(cè)結(jié)果與確證試驗(yàn)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。利用Kappa系數(shù)評(píng)估TRFIA與確證試驗(yàn)結(jié)果一致性，當(dāng)Kappa值大于等于0.75時(shí)表明兩種方法的一致性較好；當(dāng)Kappa值大于等于0.4，而小于0.75時(shí)，表明兩種方法的一致性一般；當(dāng)Kappa值小于0.4時(shí)表明兩種方法一致性很差[12]。本實(shí)驗(yàn)室TRFIA方法與確證試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致性的Kappa值為0.690，表明兩種方法定性結(jié)果的一致性一般，因此，需要對(duì)臨界值進(jìn)行調(diào)整。

ROC曲線法是較為實(shí)用、較為便捷的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,其能較準(zhǔn)確的確定方法學(xué)的臨界點(diǎn)[13]。而常用約登指數(shù)來評(píng)價(jià)篩查試驗(yàn)的真實(shí)性,其指數(shù)越大，說明該篩查實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性越好，準(zhǔn)確性越高[7]。本實(shí)驗(yàn)利用ROC曲線，取約登指數(shù)最大時(shí)的拐點(diǎn)，確定最佳臨界值為0.074 IU/mL，此時(shí)，ROC曲線下面積為0.924。ROC曲線下面積在0.5～1.0，而當(dāng)ROC曲線下面積在 0.9～1.0時(shí)，才具有較高的診斷價(jià)值[14]。本實(shí)驗(yàn)ROC曲線下面積為0.924，因此說明定量試驗(yàn)有較高的診斷價(jià)值。在新的臨界值下，TRFIA方法與確證試驗(yàn)一致性的Kappa值為0.814，大于0.75，表明此時(shí)，兩種方法的一致性較好，也提示新的臨界值有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

TRFIA方法相對(duì)于傳統(tǒng)的 ELISA 方法檢測(cè)的靈敏度有顯著的提高，但是同時(shí)也出現(xiàn)一定的弱陽性標(biāo)本，即灰區(qū)，灰區(qū)范圍的設(shè)定非常重要，范圍設(shè)置過窄容易漏檢，過寬容易造成資源浪費(fèi)。本研究根據(jù)臨界值±2CV法確定的灰區(qū)范圍為-0.126～0.274 IU/mL，灰區(qū)的下限-0.126 IU/mL，顯然不合理(所有陰性均可疑)，大于灰區(qū)上限的標(biāo)本中有2.13%的假陽性率，小于5%統(tǒng)計(jì)學(xué)上可接受的誤差范圍。試劑說明書給定的灰區(qū)范圍為0.04～0.06 IU/mL,在小于灰區(qū)下限的標(biāo)本中假陰性率為0%,小于5%統(tǒng)計(jì)學(xué)上可接受的誤差范圍。而大于灰區(qū)上限的標(biāo)本中假陽性率為14.89%，大于5%統(tǒng)計(jì)學(xué)上可接受的誤差范圍，因此設(shè)置不合理。試劑說明書給定的臨界值為0.05 IU/mL，而以0.05 IU/mL作為灰區(qū)的下限時(shí)，小于灰區(qū)下限的標(biāo)本中有1.50%假陰性率，小于5%統(tǒng)計(jì)學(xué)上可接受的誤差范圍。相比較于灰區(qū)下限0.04 IU/mL，0.05 IU/mL作為灰區(qū)的下限既能滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)可接受的誤差范圍，又不至于灰區(qū)范圍過寬，導(dǎo)致資源的浪費(fèi)。因此，綜合考慮，本研究得出本實(shí)驗(yàn)室的灰區(qū)范圍為0.05～0.274 IU/mL，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室有較佳的參考意義。

4 結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室TRFIA法檢測(cè)HBV表面抗原的最佳臨界值0.074 IU/mL，灰區(qū)為0.05～0.274 IU/mL，與試劑說明給定臨界值的0.05 IU/mL，灰區(qū)0.04～0.06 IU/mL有一定的差別。因此，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，對(duì)TRFIA法檢測(cè)HBV表面抗原的臨界值及灰區(qū)進(jìn)行重新設(shè)定。對(duì)于定量值在灰區(qū)的標(biāo)本，工作人員應(yīng)與患者或其醫(yī)師溝通，了解情況后，綜合判斷，客觀報(bào)告“結(jié)果可疑，定期復(fù)查”。