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    響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母中S-腺苷甲硫氨酸的提取工藝

    2019-10-08 03:49:06張曉青張愛(ài)君司曉光王樹(shù)勛曹軍瑞
    食品科學(xué) 2019年18期
    關(guān)鍵詞:胞內(nèi)爬坡釀酒

    杜 瑾,張曉青,張愛(ài)君,司曉光,王樹(shù)勛,曹軍瑞*

    (自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所,天津 300192)

    S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是一種有機(jī)四價(jià)硫形式甲硫氨酸磺?;衔铮瑥V泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi),參與40多種生化反應(yīng),在轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫基中起重要作用,被稱為“活性甲硫氨酸”[1]。臨床上廣泛用于肝炎、關(guān)節(jié)炎、抑郁癥和各種肝病的治療[2-3],在食品添加劑領(lǐng)域也有著巨大的市場(chǎng)需求。微生物發(fā)酵技術(shù)制備SAM具有成本低廉、易于操作等優(yōu)點(diǎn),是目前SAM工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法[4],采用的微生物主要為釀酒酵母[5]、畢赤酵母[6]等酵母菌。

    酵母菌積累SAM的能力較強(qiáng),但由于SAM是胞內(nèi)產(chǎn)物,在分離純化過(guò)程中首先要破碎較厚的酵母細(xì)胞壁,最大限度地提取SAM產(chǎn)物。文獻(xiàn)中報(bào)道較多的破碎酵母釋放SAM方法主要是化學(xué)試劑法,其中應(yīng)用最廣的萃取劑為高氯酸和乙酸乙酯-硫酸[7-8]。高氯酸法的萃取效果近似達(dá)到100%,是早期提取SAM的主要方法,但高氯酸的危險(xiǎn)性較高,目前僅用作萃取標(biāo)準(zhǔn)[9]。乙酸乙酯-硫酸法萃取率可達(dá)到90%,但有機(jī)溶劑用量大,提取成本和污染性均較高。近年來(lái),開(kāi)發(fā)安全、高效、環(huán)保的SAM提取工藝受到關(guān)注。如已有研究采用硫酸溶液在70 ℃熱水條件[10]和4 ℃冷水條件[11]提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM。李繼安等[12]采用無(wú)機(jī)強(qiáng)酸水溶液并凍融處理提取SAM。李勇等[13]采用高壓氮?dú)鈹D壓式細(xì)胞破碎法破碎酵母細(xì)胞釋放胞內(nèi)SAM。

    超聲波可通過(guò)水介質(zhì)的空化作用,使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破碎,釋放內(nèi)容物,在較短的提取時(shí)間內(nèi)提高提取效率,具有設(shè)備需求低、操作簡(jiǎn)便、安全性好等優(yōu)點(diǎn),常用于食品工業(yè)中產(chǎn)物提取過(guò)程的強(qiáng)化和優(yōu)化[14-15],可用于提取酵母細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)[16-17]。本研究創(chuàng)新采用低濃度鹽酸溶液作為提取液,輔以超聲破碎酵母細(xì)胞,通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母胞內(nèi)SAM提取的最佳工藝條件,為實(shí)現(xiàn)SAM的高效、環(huán)保制備提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌體由自然資源部第三海洋研究所提供。

    SAM標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;甲醇、甲酸銨(均為色譜純) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ZHWY-2102C型恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;3K15型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;SFX550型超聲波破碎儀 美國(guó)Branson公司;ACQUITY型超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

    1.3 方法

    1.3.1 SAM含量測(cè)定

    采用超高效液相色譜測(cè)定SAM,檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[18]。色譜柱為BECH C18反相柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相0.01 mol/L甲酸銨,pH 3~4;流速0.3 mL/min;柱溫30 ℃。二極管陣列檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。SAM標(biāo)準(zhǔn)品及分析樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

    1.3.2 SAM提取量和提取率的計(jì)算

    SAM提取量的計(jì)算如式(1)所示:

    式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出測(cè)量液中SAM的質(zhì)量濃度/(mg/mL);V為提取液體積/mL;N為稀釋倍數(shù);W為釀酒酵母菌體干質(zhì)量/g。

    SAM提取率的計(jì)算如式(2)所示:

    式中:X為SAM提取量/(mg/g);X0為采用高氯酸法提取SAM的提取量/(mg/g)。

    1.3.3 SAM提取液的篩選

    準(zhǔn)確稱取0.2 g酵母干細(xì)胞,加入6 mL不同提取液,分別為1.5 mol/L高氯酸、1.5 mol/L鹽酸、0.1 mol/L鹽酸、0.01 mol/L鹽酸、0.001 mol/L鹽酸,常溫振蕩處理4 h;或加入2 mL乙酸乙酯-水溶液(體積比1∶1)振蕩提取1 h后,再加入4 mL 0.4 mol/L硫酸溶液振蕩提取3 h。4 ℃、8 000 r/min離心15 min,去除破碎菌體,收集上清液,用于SAM含量測(cè)定。以SAM提取量和提取率為指標(biāo),綜合考慮有機(jī)溶劑用量、SAM穩(wěn)定性等因素,選擇合適的提取液。

    1.3.4 超聲輔助提取的單因素試驗(yàn)

    以0.1 mol/L鹽酸為提取液,固定超聲輔助提取的基本參數(shù)為超聲功率250 W、超聲時(shí)間(指總的超聲工作時(shí)間,下同)5 min、超聲時(shí)間間隔10∶10 (工作時(shí)間∶間歇時(shí)間,s/s)、料液比1∶30 (g/mL)。在基本超聲參數(shù)下,分別考察超聲功率(100、150、200、250、300、350、400 W)、超聲時(shí)間(1、2、3、4、5、6、7 min)、時(shí)間間隔(10∶3、10∶5、10∶8、10∶10、8∶10、5∶10、3∶10(s/s))、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL))4 個(gè)因素對(duì)SAM提取量的影響。

    1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)

    選擇超聲功率、超聲時(shí)間、時(shí)間間隔、料液比4 個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察SAM提取量,篩選出影響SAM提取量的重要因素。試驗(yàn)各因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

    表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Experimental factors and levels used in Plackett-Burman design

    1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著影響因素的正負(fù)效應(yīng),設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的爬坡方向和步長(zhǎng),使SAM提取量逼近最佳值反應(yīng)區(qū)域[19]。

    1.3.7 超聲輔助提取SAM工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    在Plackett-Burman試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),對(duì)SAM提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)各因素編碼和水平設(shè)置見(jiàn)表2。

    表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    每組3 次平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。采用Office Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)制圖。Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SAM提取液及濃度的確定

    傳統(tǒng)工藝一般采用1.5 mol/L高氯酸或乙酸乙酯-硫酸提取酵母菌體胞內(nèi)SAM。按照1.3.3節(jié)方法,選取不同提取液以及不同濃度的鹽酸溶液,提取效果如表3所示。

    由表3可知,1.5 mol/L高氯酸提取量最高,文獻(xiàn)中通常作為SAM提取量100%計(jì)算。乙酸乙酯提取率達(dá)91.3%,與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。為降低操作危險(xiǎn)性和對(duì)環(huán)境污染,本研究采用不同濃度鹽酸提取釀酒酵母菌體中SAM,以期采用低濃度鹽酸提取胞內(nèi)SAM。結(jié)果顯示,SAM提取量隨鹽酸濃度降低而降低。當(dāng)鹽酸濃度降低至0.01 mol/L時(shí),提取率可達(dá)到65.7%;但當(dāng)鹽酸濃度降低至0.001 mol/L時(shí),提取率降低至32.9%。同時(shí),由于SAM在酸性條件下穩(wěn)定,而鹽酸濃度低于0.01 mol/L時(shí),溶液pH值高于2,不利于SAM穩(wěn)定性。因此,選取0.01 mol/L鹽酸為提取液,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

    表3 不同提取液對(duì)SAM提取效果的影響Table 3 Effect of different solvents on the extraction yield of SAM

    2.2 超聲輔助提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 超聲功率對(duì)SAM提取量的影響

    圖1 超聲功率對(duì)釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 1 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae

    由圖1可知,釀酒酵母中SAM提取量首先隨超聲功率的增大而增加,當(dāng)超聲功率為300 W時(shí)達(dá)到最大,而后逐漸下降。這是由于超聲功率越大,超聲波在提取溶液中產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械作用的強(qiáng)度越大,其破碎酵母細(xì)胞壁的效果越好[20],越有利于釋放胞內(nèi)SAM。但過(guò)高的超聲功率會(huì)使SAM分子結(jié)構(gòu)變化或降解,也會(huì)使更多的胞內(nèi)雜質(zhì)溶入提取液中,影響SAM提取量,增加后續(xù)分離純化工藝的難度。因此,選擇超聲功率為300 W。

    2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)SAM提取量的影響

    圖2 超聲時(shí)間對(duì)釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 2 Effects of ultrasonic irradiation time on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae

    由圖2可知,在超聲時(shí)間1~3 min范圍內(nèi),SAM提取量隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而增加,當(dāng)超聲時(shí)間為3 min時(shí)達(dá)到最大,而后SAM提取量趨于平緩,至7 min時(shí)明顯下降。這是由于超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破壞能夠隨時(shí)間延長(zhǎng)而更加充分,使胞內(nèi)SAM完全釋放,但過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)造成天然活性產(chǎn)物降解[21]。因此,選擇超聲時(shí)間為3 min。

    2.2.3 超聲時(shí)間間隔對(duì)SAM提取量的影響

    圖3 超聲時(shí)間間隔對(duì)釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 3 Effects of ultrasonic irradiation interval on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae

    如圖3所示,超聲時(shí)間間隔10∶3~10∶10時(shí),SAM提取量隨間歇時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,而后隨著時(shí)間間隔比值的減小,SAM提取量基本持平。這是由于超聲波破壞酵母細(xì)胞壁的過(guò)程中伴隨著熱量積聚[22],間歇時(shí)間過(guò)短不利于熱量擴(kuò)散,且SAM具有熱不穩(wěn)定性,造成SAM降解、提取量降低。而當(dāng)總工作時(shí)間一定時(shí),胞內(nèi)SAM已充分釋放,即使增加間歇時(shí)間也不能提高SAM提取量,反而會(huì)增加SAM提取過(guò)程的總耗時(shí)。因此,選擇超聲時(shí)間間隔為10∶10(s/s)。

    2.2.4 料液比對(duì)SAM提取量的影響

    圖4 料液比對(duì)釀酒酵母中SAM提取量的影響Fig. 4 Effects of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of SAM from S. cerevisiae

    由圖4可知,在料液比1∶10~1∶25(g/mL)范圍內(nèi),由于細(xì)胞內(nèi)與溶劑間溶質(zhì)濃度差隨提取劑體積的增加而增大,傳質(zhì)推動(dòng)力提高[23],SAM提取量隨之增大。但在料液比達(dá)到1∶25(g/mL)之后,SAM已被充分提取,進(jìn)一步增加提取劑用量,SAM提取量仍基本持平。綜合考慮提取效果和提取劑成本,選擇料液比為1∶25(g/mL)。

    2.3 Plackett-Burman法篩選影響SAM提取效果的主要因素

    以影響SAM提取量的超聲條件作為4 個(gè)因素,選用N為12進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),X1、X3、X5、X7分別代表超聲功率、超聲時(shí)間、時(shí)間間隔、料液比,設(shè)計(jì)X2、X4、X6、X8、X9、X10空白作為誤差分析項(xiàng)。每個(gè)因素分別選取了高(1)和低(-1)兩個(gè)水平,以SAM產(chǎn)量作為響應(yīng)值。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見(jiàn)表4,每個(gè)試驗(yàn)設(shè)2 個(gè)平行樣,結(jié)果取平均值。

    表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Plackett-Burman design with response variable

    使用Design-Expert 8.06軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,影響SAM產(chǎn)量因素主效應(yīng)分析結(jié)果見(jiàn)表5?;貧w模型的主效應(yīng)P小于0.000 1,說(shuō)明Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素在所選取的水平范圍內(nèi)對(duì)SAM提取量的影響顯著。從SAM提取量響應(yīng)值方面分析,時(shí)間間隔(X5,P=0.244 4)對(duì)SAM提取量影響不顯著(P>0.05)。料液比(X7,P<0.000 1)、超聲功率(X1,P=0.000 7)、超聲時(shí)間(X3,P=0.019 4)對(duì)SAM提取量影響顯著(P<0.05),其影響順序?yàn)榱弦罕龋境暪β剩境晻r(shí)間。因此,選取該3 個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),進(jìn)一步逼近其最佳區(qū)域。

    表5 SAM提取量影響因素主效應(yīng)分析Table 5 Main effect analysis of the extraction yield of SAM versus various factors

    2.4 最陡爬坡試驗(yàn)確定因素水平

    由Plackett-Burman試驗(yàn)回歸方程中確定的3 個(gè)重要因素的變量確定試驗(yàn)范圍和爬坡步長(zhǎng),設(shè)計(jì)最陡爬坡路徑[24],試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6??梢钥闯?,SAM提取量變化趨勢(shì)為先上升再趨于平穩(wěn),在第4組試驗(yàn)中SAM提取量達(dá)到最大(55.45 mg/g)。因此,選擇第4組試驗(yàn)的各因素取值作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn),即超聲功率300 W、超聲時(shí)間4 min、料液比1∶25(g/mL)。

    表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Steepest ascent design with experimental results

    2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化SAM提取工藝

    2.5.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)及最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken設(shè)計(jì),以超聲功率(X1)、超聲時(shí)間(X3)、料液比(X7)為因變量共設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表7。

    表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Box-Behnken design with experimental results

    利用Design-Expert 8.06軟件對(duì)表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到以SAM提取量為響應(yīng)值的回歸方程為:

    對(duì)回歸模型作顯著檢驗(yàn)和方差分析,結(jié)果見(jiàn)表8。該模型的P值小于0.001,失擬項(xiàng)P值為0.094 4(>0.05),表明該模型失擬不顯著,但回歸極顯著。該模型R2為0.968 4,調(diào)整后R2為0.927 7,表明該模型能夠解釋92.77%關(guān)鍵因素對(duì)釀酒酵母菌體中SAM提取量的影響,可以用其確定最佳提取工藝條件。

    表8 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8 Analysis of variance of quadratic polynomial model

    從表8可知,回歸方程一次項(xiàng)X3對(duì)SAM提取量的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05),X1、X7達(dá)到極顯著水平(P<0.01),3 個(gè)因素對(duì)SAM提取量的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋╔7)>超聲功率(X1)>超聲時(shí)間(X3)。二次項(xiàng)為極顯著。

    2.5.2 響應(yīng)面分析

    響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述,能夠直觀反映各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素間交互作用的類型[25-27]。三因素的兩兩交互作用體現(xiàn)在相應(yīng)曲面圖中時(shí),曲面呈馬鞍型且等高線呈橢圓形表示兩因素交互影響顯著,而曲面呈圓滑型且等高線呈圓形則表示兩因素之間交互作用不顯著[28-29]。超聲輔助低濃度鹽酸提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM的工藝條件中,各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。

    從圖5可以看出,影響釀酒酵母胞內(nèi)SAM提取量的3 個(gè)因素(超聲功率、超聲時(shí)間、料液比)兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖都較平緩,等高線圖的橢圓形都較不明顯,接近圓形,表明超聲功率與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與料液比、超聲功率與料液比之間有一定的交互作用,但交互效應(yīng)均較弱。結(jié)合表8結(jié)果,交互項(xiàng)X1X3、X1X7、X3X7對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析均為P>0.05,表明超聲功率、超聲時(shí)間和料液比這3 個(gè)因素的兩兩交互作用不顯著,與圖5中響應(yīng)面和等高線圖所示結(jié)果一致。

    上述回歸模型的最佳值存在響應(yīng)面最高點(diǎn),等高線圖的圓心,即SAM提取量最大時(shí)的穩(wěn)定點(diǎn),與之對(duì)應(yīng)的因素水平即為最佳工藝條件[30]。通過(guò)Design-Expert 8.06軟件計(jì)算得出,提取釀酒酵母胞內(nèi)SAM的最佳條件為超聲功率314 W、超聲時(shí)間4.11 min、料液比1∶27(g/mL),在此優(yōu)化條件下,SAM提取量的理論值為65.92 mg/g。

    2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    鑒于實(shí)際操作的可行性,將SAM提取條件修正為超聲功率314 W、超聲時(shí)間4.1 min、料液比1∶27(g/mL),平行實(shí)驗(yàn)3 次,得到的SAM提取量為66.56 mg/g,與預(yù)測(cè)值相差0.98%,說(shuō)明用該模型所獲得的優(yōu)化提取條件可靠。此時(shí),以高氯酸法提取率為100%所計(jì)算的SAM提取率為92.1%。

    3 結(jié) 論

    本研究比較了高氯酸、乙酸乙酯-硫酸和不同濃度鹽酸對(duì)釀酒酵母菌胞內(nèi)SAM提取量和提取率的影響,選取0.01 mol/L鹽酸為提取液。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)得出了關(guān)鍵影響因素及水平,最后利用Box-Behnken法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)獲得最優(yōu)工藝條件為超聲功率314 W、超聲時(shí)間4.1 min、料液比1∶27(g/mL),此時(shí)SAM提取量為66.56 mg/g,SAM提取率可達(dá)92.1%。此方法以較低濃度鹽酸為提取液并輔以超聲波破碎細(xì)胞壁,與傳統(tǒng)的高氯酸法和乙酸乙酯-硫酸法相比,有機(jī)溶劑用量少、安全性較高,有利于SAM的進(jìn)一步研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

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