超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)解析沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

丁麗娜，邱亦亦，束 彤，阮 暉,3,4,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.青海省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海 西寧 810008；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；4.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波 315100）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）別稱醋柳、酸刺、達(dá)日布，為胡頹子科沙棘屬的多年生落葉性灌木或喬木，是一種喜光、耐水、耐旱、生長(zhǎng)性極好的小漿果植物，多為橘黃色或橘紅色[1-4]。我國(guó)是沙棘資源最豐富的國(guó)家，有“沙棘王國(guó)”之稱，沙棘藥食兩用方面的研究和應(yīng)用在我國(guó)具有悠久歷史[5]。

沙棘果實(shí)中富含生物活性物質(zhì)，如維生素、脂肪酸、黃酮類、酚類及有機(jī)酸、氨基酸和蛋白質(zhì)、微量元素等。對(duì)其功效性天然產(chǎn)物的分離提取、結(jié)構(gòu)解析和應(yīng)用已開(kāi)展較多研究，例如：沙棘油是沙棘果實(shí)中的最有價(jià)值的組分之一，對(duì)心腦血管、胃腸道、肝臟、皮膚組織等具有保護(hù)及修復(fù)作用[6]。并且，由于沙棘中含有大量氨基酸、有機(jī)酸、酚酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)胃酸合成和分泌。因而其具有消食化滯、健脾養(yǎng)胃、疏肝利氣的作用。對(duì)于消化不良、腹脹痛、胃炎、胃潰瘍、腸炎、慢性便秘等均有極好作用。目前已有大量研究指出，沙棘及其提取物具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基、對(duì)抗炎癥、抗病毒、抗過(guò)敏、抗疲勞等作用[7-10]。

沙棘果富含黃酮[11-14]，沙棘黃酮顯示出抗氧化、免疫調(diào)理、抗腫瘤等多重功效[15-17]。從沙棘葉中分離到蘆丁、槲皮素及其配糖體（3-O-葡萄糖苷）、山柰酚、異鼠李素等[18]。從沙棘籽中分離到蕓香糖苷槲皮素、蕓香糖苷異鼠李素、葡萄糖苷蕓香糖苷槲皮素、山柰酚、異鼠李素等[17]。采用高效液相色譜和超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）技術(shù)，建立了基于7 種黃酮組分的沙棘葉質(zhì)量控制方法[19]。超臨界CO2萃取技術(shù)在食品醫(yī)藥上應(yīng)用較多，萃取劑CO2無(wú)毒、安全、廉價(jià)，其氣液臨界態(tài)溫度為31.7 ℃，可以在較低溫度下萃取，既節(jié)約能耗，又避免活性物質(zhì)發(fā)生熱降解和發(fā)生副反應(yīng)[20]。由于其低溫提取、無(wú)有毒殘溶和可以選擇性分離等優(yōu)點(diǎn)，超臨界CO2萃取技術(shù)成為提取純化功效性天然產(chǎn)物的重要手段。之前的研究中，已采用超臨界CO2萃取技術(shù)高效獲取了沙棘果油[21-22]，但對(duì)其中所含黃酮類成分及結(jié)構(gòu)尚未做過(guò)系統(tǒng)解析。本研究以青海產(chǎn)沙棘果為研究對(duì)象，采用超臨界CO2萃取技術(shù)獲得沙棘果油，通過(guò)UPLC-MS技術(shù)和Peakview軟件擬合、二級(jí)質(zhì)譜解析和紫外光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)，全面解析沙棘果中黃酮類成分及結(jié)構(gòu)，為沙棘的高值化開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）產(chǎn)于青海省。

乙醇（一級(jí)色譜純） 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；所有黃酮類標(biāo)品（色譜純≥98%） 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HGC-12A氮吹儀 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SFE-2超臨界CO2萃取儀 美國(guó)Applied Separations公司；I-class UPLC儀 美國(guó)Waters公司；Triple TOF 5600+型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Peakview色譜工作站） 美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取適量沙棘干果，置于烘箱中以55 ℃烘干，再用粉碎機(jī)碎至粒狀，過(guò)40 目篩，得沙棘粉末。取適量沙棘粉，裝入50 mL提取釜中，設(shè)置提取條件：萃取壓力35 MPa，萃取溫度45 ℃，提取時(shí)間1 h，出口閥溫度110 ℃。待萃取完畢，再以無(wú)水乙醇為夾帶劑，流速0.8 mL/min，按照相同的萃取條件，更換新的萃取瓶來(lái)收集萃取液。待萃取完畢后，將萃取液溶解、濃縮、冷凍離心至合適濃度，過(guò)0.22 μm濾膜，待做UPLC-MS。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取槲皮素、二氫槲皮素、山柰酚、橙皮素、異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并配制成每個(gè)組分約0.05 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，備用。參考對(duì)照品的質(zhì)譜裂解特征，解析黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法

色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX-SBC18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫，0 min 5% B，2 min 5% B，25 min 50% B，33 min 95% B；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時(shí)間液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，正負(fù)離子掃描模式；掃描范圍，m/z100～1 500；霧化氣（GS1）壓力55 psi；霧化氣（GS2）壓力55 psi；氣簾氣壓力35 psi；離子源溫度：600 ℃（正），-550 ℃（負(fù)）；離子源電壓5 500 V（正），-4 500 V（負(fù)）；一級(jí)掃描，去簇電壓100 V，聚焦電壓10 V；二級(jí)掃描，使用TOF MS～Product Ion～I(xiàn)DA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為20、40 V和60 V，進(jìn)樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2×10-6。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

在已有文獻(xiàn)基礎(chǔ)之上，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜給出化合物的準(zhǔn)分子離子峰，得到化合物的相對(duì)分子質(zhì)量，從而縮小鑒定化合物的范圍。然后經(jīng)Peakview色譜工作站擬合，對(duì)比黃酮的紫外吸收峰，結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)其可能的分子式和分子質(zhì)量。進(jìn)一步再做二級(jí)質(zhì)譜解析，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品、已報(bào)道的紫外光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比對(duì)，確定黃酮化合物的分子結(jié)構(gòu)或者其同分異構(gòu)體。對(duì)于無(wú)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品的黃酮化合物，則通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜解析推測(cè)其裂解途徑，確定其分子結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)共計(jì)發(fā)現(xiàn)18 種黃酮類化合物，按其結(jié)構(gòu)類型可分為5 類，其中包括8 種黃酮醇苷元及黃酮醇苷，3 種二氫黃酮醇苷元及二氫黃酮醇苷，5 種黃酮苷元及黃酮苷，1 種二氫黃酮苷元和1 種黃烷醇苷。鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類化合物的鑒定結(jié)果Table 1 Main flavonoids identified in the supercritical CO2 extract of sea buckthorn berries

本研究采用的液相色譜-質(zhì)譜條件使得超臨界CO2流體萃取出的沙棘果萃取液中主要活性成分得到有效分離。圖1為沙棘果超臨界CO2萃取物的液相色譜圖和質(zhì)譜總離子圖。黃酮類化合物在負(fù)離子模式下干擾較少，也易被離子化，碎片信息更為準(zhǔn)確，故本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)離子模式分析這些化合物。

圖1 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮的UPLC-紫外檢測(cè)（A）及總離子流圖（B）Fig. 1 UPLC-UV chromatogram and total ion current chromatogram of flavonoid compounds in the supercritical CO2 extract of sea buckthorn berries

采用質(zhì)譜技術(shù)，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果，解析化合物裂解途徑，確定沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類成分的結(jié)構(gòu)。

為方便討論黃酮苷元及糖苷質(zhì)譜斷裂形成的碎片離子，本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃酮類化合物裂解后的特征碎片離子進(jìn)行了系統(tǒng)命名。如圖2所示，其中，對(duì)黃酮苷元，i,jA和i,jB分別表示該黃酮苷元的碎片包含A-環(huán)和B-環(huán)，上標(biāo)i和j顯示了C環(huán)上鍵的斷裂位置。對(duì)黃酮苷，k,lXj表示該碎片依然包括了黃酮苷元，j表示第j個(gè)糖基上鍵的斷裂（從黃酮苷元數(shù)起），k和l顯示了糖基環(huán)斷裂的位置。

圖2 本研究中裂解途徑所產(chǎn)生碎片的系統(tǒng)命名Fig. 2 Nomenclature adopted for various retrocyclization fragments observed in this study

2.1.1 化合物2、4、6、8、9、13、15、16的斷裂規(guī)律

化合物2、4、6、8、9、13、15、16皆為黃酮醇及其苷類，而其中化合物2經(jīng)推斷為紫云英苷，即山柰酚-3-O-葡萄糖苷，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C21H20O11，相對(duì)分子質(zhì)量為448。在負(fù)離子模式下，紫云英苷產(chǎn)生一級(jí)離子峰m/z447 [M-H]-，m/z447丟失一分子CH2O2后得到m/z401，丟失一分子CH2O4得到碎片m/z369，丟失一分子C3H6O3得到碎片m/z367。這其中，m/z357通過(guò)丟失一分子-C2H2-得到碎片m/z331，通過(guò)丟失一分子CH2O得到m/z 327，而m/z 327丟失一分子CO得到m/z 299，再丟失1 個(gè)—CH2—得到m/z 285，再通過(guò)連續(xù)丟失一分子CO和—OH分別得到碎片m/z 257和m/z 240。而一級(jí)離子峰m/z 447通過(guò)丟失C12H16O6后得到碎片m/z 191，再丟失一分子—CHO得到m/z 162，或者通過(guò)丟失一分子C2H2O2得到m/z 133，m/z 133丟失一分子H2O得到碎片m/z 115。二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子峰皆可由紫云英苷通過(guò)相應(yīng)的鍵斷裂而得，并且二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[23-24]一致。因此，化合物2推測(cè)為紫云英苷。

化合物4經(jīng)推測(cè)為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C22H22O12，相對(duì)分子質(zhì)量為478。該物質(zhì)二級(jí)碎片較集中且碎片離子豐度較大，在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生一級(jí)離子碎片m/z 477 [M-H]-，m/z 477通過(guò)丟失一分子CO得到碎片m/z 433，通過(guò)丟失一分子葡萄糖—C6H10O5得到m/z 315，再丟失1 個(gè)H得到m/z 314，通過(guò)丟失一分子—CH3得到m/z 300，再連續(xù)丟失一分子—CHO和CO分別得m/z 271和m/z 243。而碎片m/z 315也可通過(guò)丟失一分子CH2O得到碎片m/z 285，再丟失一分子C6H4O4得到m/z 145。二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子峰皆可由異鼠李素-3-O-葡萄糖苷通過(guò)相應(yīng)的鍵斷裂而得，并且二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[25]一致。因此，化合物4推測(cè)為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

化合物6為山柰酚-3-O-鼠李糖苷，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C21H20O10，相對(duì)分子質(zhì)量為432。取代基R5、R7以及R4′為羥基，而R3被O-鼠李吡喃糖苷取代。在負(fù)離子模式下，山柰酚-3-O-鼠李吡喃糖苷產(chǎn)生m/z 431 [M-H]-，m/z 431丟失一分子—C6H10O4即鼠李吡喃糖苷得到m/z 285，m/z 285再脫去1 個(gè)H得到m/z 284，在質(zhì)譜圖中，m/z 285離子豐度要大于m/z 284，這說(shuō)明前者離子比后者穩(wěn)定。而m/z 285再丟失一分子CO得到m/z 257，碎片離子m/z 257丟失一分子CO2，得到m/z 213。如該化合物的裂解途徑所示，碎片m/z 213極不穩(wěn)定，因此在二級(jí)質(zhì)譜中的含量也極低。此外，山柰酚-3-O-鼠李吡喃糖苷還發(fā)生了RDA反應(yīng)，產(chǎn)生典型離子峰m/z 151。

化合物8為黃酮醇衍生物，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C22H22O11，相對(duì)分子質(zhì)量為462。取代基R5、R7和R4′為羥基，R3為O-鼠李糖苷，而R3′則被甲氧基取代。負(fù)離子條件下，產(chǎn)生分子離子峰為[M—H]-m/z 461，脫去鼠李糖基得到苷元離子m/z 315，接著脫去1 個(gè)H和2 個(gè)H分別得到m/z 314、313，在質(zhì)譜圖中，m/z 315離子豐度遠(yuǎn)大于m/z 314、313，證明m/z 315比后兩個(gè)都要穩(wěn)定。m/z 315丟失一分子—CH3得到m/z 300，m/z 300再脫去1 個(gè)H得到m/z 299，m/z 299也可由m/z 314丟失一分子—CH3得到，因此m/z 299的離子豐度稍大于m/z 300。緊接著m/z 300、299分別失去一分子CO，產(chǎn)生m/z 272、m/z 271，m/z 271再脫去一分子CO得到m/z 243，除此之外，m/z 461發(fā)生RDA裂解得到1,3A m/z 151。

化合物9為槲皮素，其分子式為C15H10O7，相對(duì)分子質(zhì)量為302，屬于黃酮醇類，其取代基R3、R5、R7、R3′、R4′為—OH，R6為H。產(chǎn)生典型離子有m/z 301 [M-H]-、273、245、229、179、151、149、121、107、93、83和65。m/z 301連續(xù)失去中性粒子CO產(chǎn)生m/z 273、m/z 245，m/z 245丟失1 個(gè)O產(chǎn)生m/z 229。除此之外，RDA裂解產(chǎn)生m/z 179（1,4B）、151（1,3A）和149（1,3B），m/z 151脫去1 個(gè)CO2得到m/z 107，m/z 149再連續(xù)脫去CO得到m/z 121、m/z 93。分子離子峰發(fā)生A環(huán)斷裂則得到m/z 83（R8、R10），再脫去1 個(gè)H2O得到m/z 65。

化合物13為山柰酚，分子式為C15H10O6，相對(duì)分子質(zhì)量為286，其取代基R3、R5、R7、R4′為—OH，R6、R8為H。除了生成分子離子峰m/z 285外，丟失1 個(gè)H2O產(chǎn)生m/z 267，再丟失1 個(gè)CO生成m/z 239，此外，A環(huán)上發(fā)生斷裂，丟失C4H2O3重排生成離子碎片m/z 187。山柰酚二級(jí)碎片極少，但對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間以及二級(jí)碎片，基本可確定化合物13為山柰酚。

化合物15為異鼠李素，其分子式為C16H12O7，相對(duì)分子質(zhì)量為316，其取代基R3、R5、R7、R4′為—OH，R6、R8為H，R3′則為甲氧基。因含有甲氧基，其分子離子峰m/z 315丟失甲基產(chǎn)生m/z 300，再丟失C4H4O2產(chǎn)生m/z 216，m/z 216丟失1 個(gè)—OH得到碎片離子m/z 199。m/z 300也可通過(guò)先丟失1 個(gè)—OH生成m/z 283，再連續(xù)丟失CO產(chǎn)生m/z 2 5 5和m/z 2 2 7。m/z 3 1 5也發(fā)生了C環(huán)常發(fā)生的斷裂（脫去C O2）從而產(chǎn)生碎片離子m/z 2 7 1，再丟失1 個(gè)C O生成m/z 243，又或者丟失C6H4O2生成m/z 163，再丟失1 個(gè)—CH3，生成m/z 148。除此之外，分子離子峰m/z 315發(fā)生RDA斷裂生成m/z 163（1,3B）和m/z 151（1,3A），碎片m/z 151丟失C3O2生成m/z 83。m/z 315的A環(huán)從C環(huán)上斷裂，生成m/z 107，再失去1 個(gè)CO2生成m/z 63。化合物11的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子相當(dāng)豐富，并且通過(guò)與異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，可知沙棘果中異鼠李素含量豐富。

化合物16為萬(wàn)壽菊素，其分子式為C16H12O8，相對(duì)分子質(zhì)量為332。其取代基R3、R5、R7、R3′、R4′為—OH，R6為甲氧基。因含有甲氧基，其分子離子峰m/z 331丟失甲基產(chǎn)生m/z 316，連續(xù)丟失CO生成m/z 303和m/z 275，而m/z 303和m/z 275再分別丟失1 個(gè)O生成m/z 287、m/z 259，m/z 259再丟失1 個(gè)O生成m/z 243。m/z 303也可通過(guò)失去C7H6O3生成m/z 165。分子離子峰m/z 331也可通過(guò)A環(huán)、B環(huán)以及C環(huán)的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子。如A環(huán)從C環(huán)上斷裂，失去C9H4O5得到m/z 139，再失去1 個(gè)O生成m/z 123，最后失去—CH—并重排生成m/z 110。從C環(huán)上斷裂失去C9H6O4生成m/z 153。也可通過(guò)失去C7H7O2生成m/z 208。除此之外，m/z 331也可發(fā)RDA斷裂，生成m/z 180（1,3A）、m/z 151（1,3B）。

2.1.2 化合物3、5、7的斷裂規(guī)律

化合物3、5、7皆為二氫黃酮醇，化合物3為二氫槲皮素，即R3、R5、R7、R3′、R4′全為—OH，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C15H12O7，相對(duì)分子質(zhì)量為304。其裂解規(guī)律具體如下：分子離子峰m/z 303失去1 個(gè)H2O生成m/z 285，再失去C9H4O5生成m/z 93；m/z 303失去1 個(gè)CO生成m/z 275；m/z 303失去1 個(gè)CO2生成m/z 259，m/z 259再失去1 個(gè)H2O生成m/z 241，也可通過(guò)失去C2H2O生成碎片離子m/z 217。而碎片m/z 217可通過(guò)丟失1 個(gè)H2O生成m/z 199，丟失1 個(gè)CO生成m/z 189，再丟失H4O2生成m/z 153，最后m/z 153丟失CO生成m/z 125，其中m/z 217還可通過(guò)再丟失1 個(gè)C2H2O生成m/z 175；m/z 303也可通過(guò)A環(huán)斷裂，丟失C11H8O5生成m/z 83；最后，分子離子峰m/z 303還可通過(guò)RDA斷裂生成m/z 151（1,3A）以及151（1,3B），m/z 151（1,3A）失去1 個(gè)CO2生成m/z 107，而151（1,3B）失去C5H2O2生成碎片m/z 57。

化合物5為3,5,7,3′-四羥基-4′-甲氧基黃酮，即二氫異鼠李素，其分子式為C16H14O7，相對(duì)分子質(zhì)量為318。其裂解規(guī)律具體如下：分子離子峰m/z 317失去1 個(gè)H2O生成m/z 299；m/z 317失去1 個(gè)CO生成m/z 289，而m/z 289可以通過(guò)丟失C4H2O2生成m/z 207，再丟失1 個(gè)—CH3生成m/z 192，或是m/z 289丟失C9H8O3生成m/z 125，或是C環(huán)發(fā)生斷裂生成m/z 165（1,3B），而m/z 165通過(guò)分別丟失C4H5O、C6H4O2和CH4生成m/z 96、m/z 57和m/z 149；m/z 317還可通過(guò)A環(huán)、C環(huán)的斷裂生成相應(yīng)的碎片離子，如丟失C7H5O3生成m/z 180，丟失C12H10O5生成m/z 83；m/z 317還可通過(guò)丟失1 個(gè)CO2生成m/z 273，而m/z 273可通過(guò)丟失C2HO生成m/z 232，丟失CO生成m/z 245，丟失—CH3生成m/z 258；m/z 317還能發(fā)生RDA斷裂，生成相應(yīng)的碎片離子，比如RDA1,3斷裂生成m/z 151（1,3A）以及m/z 167（1,3B）這些很典型的二級(jí)碎片，而m/z 167（1,3B）丟失1 個(gè)甲基生成m/z 152。

化合物7為二氫山柰酚，即跟山柰酚相比較，連接C環(huán)上R2、R3的是C—C單鍵，而非雙鍵。其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C15H12O6，相對(duì)分子質(zhì)量為287。二氫山柰酚的二級(jí)碎片較少，除了分子離子峰m/z 287外，還產(chǎn)生幾個(gè)比較典型的二級(jí)碎片離子，如經(jīng)RDA斷裂生成m/z 135（1,3B）和m/z 151（1,3A），或是A環(huán)從C環(huán)上斷裂，丟失C9H8O4生成m/z 107。

2.1.3 化合物1、11、14、17、18的斷裂規(guī)律

化合物1、11、14、17、18皆為黃酮苷元及其苷類，其中化合物1為芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C26H28O14，相對(duì)分子質(zhì)量為564，該物質(zhì)在沙棘果中是首次報(bào)道。芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷在沙棘中含量較低，因此二級(jí)碎片豐度也較小。除了出現(xiàn)明顯的分子離子峰[M-H]-m/z 563外，二級(jí)裂解后通過(guò)丟失一分子C6H12O6得到碎片m/z 383，再丟失一分子CH2O得到m/z 353。除此之外，m/z 563通過(guò)丟失C13H14O6后得到m/z 297，再丟失一分子CH2O得到碎片m/z 267。m/z 563還可通過(guò)丟失一分子CH2O2得到碎片m/z 517，再連續(xù)丟失一分子CO2和CH2O分別得到碎片m/z 473和m/z 443。二級(jí)碎片皆可由芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷通過(guò)丟失相應(yīng)的碎片得到，并且二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[27]一致，所以推測(cè)基本正確。

化合物11為苜蓿素，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C17H14O7，相對(duì)分子質(zhì)量為330，屬于黃酮苷元。在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生分子離子峰[M-H]-m/z 329，因存在兩個(gè)—CH3，因此在二級(jí)質(zhì)譜上產(chǎn)生明顯的兩個(gè)丟失—CH3的碎片，分別為m/z 314和m/z 299，再連續(xù)丟失CO得到碎片m/z 271、m/z 243、m/z 215，碎片m/z 243丟失1 個(gè)O得到m/z 227。除此之外，m/z 329通過(guò)丟失C6H6O3重排得到m/z 203。

化合物14為香葉木素，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C6H12O6，相對(duì)分子質(zhì)量為300，屬于黃酮苷元。取代基R5、R7、R3′為羥基，R4′被甲氧基取代。香葉木素除了出現(xiàn)明顯的分子離子峰[M-H]-m/z 299外，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜裂解后，丟失—CH3得到m/z 284，再脫去1 個(gè)CO得到m/z 256。二級(jí)質(zhì)譜碎片離子較少，可能與香葉木素在萃取物中的濃度有關(guān)，但根據(jù)其裂解規(guī)律，可推斷該化合物為香葉木素。

化合物17推測(cè)為紫羅蘭素，為黃酮苷元，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C18H16O8，相對(duì)分子質(zhì)量為360。在負(fù)離子模式下，產(chǎn)生一級(jí)分子離子峰[M-H]-m/z 359，二級(jí)裂解途徑有以下幾種：m/z 369通過(guò)丟失一分子C4H6O2生成m/z 273，再通過(guò)丟失一分子—CH3生成碎片m/z 258，再通過(guò)連續(xù)丟失CO生成m/z 230、m/z 202、m/z 174；m/z 369通過(guò)連續(xù)丟失一分子—CH3生成m/z 344、m/z 329，而m/z 329通過(guò)丟失一分子CO生成碎片m/z 301，或通過(guò)丟失一分子—OH生成碎片m/z 327，再連續(xù)丟失一分子H2O生成碎片m/z 309、m/z 291，m/z 291再丟失一分子CO2生成碎片m/z 247。

化合物18推測(cè)為刺槐黃素，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C16H12O5，相對(duì)分子質(zhì)量為284。該物質(zhì)在負(fù)離子模式下，主要以一級(jí)分子離子峰[M-H]-m/z 283直接裂解產(chǎn)生的二級(jí)碎片為主，如發(fā)生RDA斷裂，生成碎片離子m/z 151（1,3A），或丟失一分子—CH3生成m/z 268，丟失一分子CO2生成碎片m/z 239，一分子H2O生成m/z 265，再丟失一分子C2O3生成碎片m/z 193，或通過(guò)B環(huán)的斷裂，丟失C5H6O生成碎片m/z 183。二級(jí)碎片都能通過(guò)刺槐黃素?cái)嗔严鄳?yīng)的鍵得到，因此，化合物18可基本推斷為刺槐黃素。

2.1.4 化合物12的斷裂規(guī)律

化合物12為3,5,7-三甲基-4′-甲氧基黃酮，即橙皮素，為二氫黃酮苷元類，其分子式經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，為C16H14O6，相對(duì)分子質(zhì)量為302。除了產(chǎn)生分子離子峰m/z 301外，質(zhì)譜圖還產(chǎn)生了一系列二級(jí)碎片，如m/z 164、m/z 201就是由m/z 301分別丟失C7H5O3、C4H4O5而產(chǎn)生的。除此之外，m/z 301還能通過(guò)丟失1 個(gè)—CH3生成碎片離子m/z 286，再丟失C7H2O4生成m/z 136。m/z 301還能通過(guò)RDA斷裂生成m/z 177（1,4B），m/z 151（1,3A）以及m/z 149（1,3B），而m/z 149丟失1 個(gè)—CH3生成碎片m/z 134，m/z 151（1,3A）丟失1 個(gè)CO2生成m/z 107，再丟失2 個(gè)C生成m/z 83，最后失去1 個(gè)H2O生成m/z 65。

2.1.5 化合物10的斷裂規(guī)律

化合物10是此次定性分離中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)黃烷醇類黃酮，推測(cè)為兒茶素-7-葡萄糖苷，經(jīng)Peakview色譜工作站模擬，分子式為C21H24O11，相對(duì)分子質(zhì)量為452，除產(chǎn)生一級(jí)分子離子峰[M-H]-m/z 451外，通過(guò)C環(huán)的斷裂，丟失CH2O2生成碎片m/z 405，再通過(guò)丟失C6H4O2生成m/z 297，丟失C8H8O得到碎片m/z 177，最后丟失1 個(gè)O得到m/z 153；碎片m/z 405還可通過(guò)丟失葡萄糖苷C6H11O5得到碎片m/z 242，再丟失C8H6O2得到碎片m/z 108，再接著丟失一分子—CHO得到m/z 79。m/z 451也可發(fā)生RDA斷裂，生成碎片離子m/z 285（1,4A）。但由于該化合物相關(guān)文獻(xiàn)較少以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的局限性，無(wú)法確定該化合物所帶的六碳糖，所以只能通過(guò)分析相應(yīng)的裂解途徑進(jìn)行化合物的推測(cè)。

2.2 結(jié)構(gòu)圖及相關(guān)裂解途徑

圖3 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 3 Chemical structures of flavonoids in the supercritical CO2 extract of sea buckthorn berries

沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖3所示。以下是幾種典型化合物（化合物3：二氫槲皮素；化合物9：槲皮素；化合物10：兒茶素-7-吡喃葡萄糖苷）的裂解途徑解析如圖4～6所示。

圖4 化合物3二氫槲皮素的裂解途徑Fig. 4 Retrocyclization pathway of the chemical dihydroquercetin and its fragments

圖5 化合物9槲皮素的裂解途徑Fig. 5 Retrocyclization pathway of quercetin and its fragments

圖6 化合物10兒茶素-7-吡喃葡萄糖苷的裂解途徑Fig. 6 Retrocyclization pathway of catechin-7-pyran glucoside and its fragments

3 結(jié)論與討論

本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)獲得沙棘果油，通過(guò)UPLC-MS和Peakview色譜工作站擬合、二級(jí)質(zhì)譜解析和紫外光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)，解析有關(guān)化合物的裂解途徑，鑒定出沙棘果油中含有18 種黃酮類化合物，包括8 種黃酮醇苷元及黃酮醇苷，3 種二氫黃酮醇苷元及二氫黃酮醇苷，5 種黃酮苷元及黃酮苷，1 種二氫黃酮苷元和1 種黃烷醇苷，其中芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷、兒茶素-7-葡萄糖苷、苜蓿素、紫羅蘭素、刺槐黃素這5 種黃酮首次被發(fā)現(xiàn)存在于沙棘果中。

超臨界CO2萃取技術(shù)具有低溫提取、無(wú)有毒殘溶和可以選擇性分離的優(yōu)點(diǎn)，并且特別適合分離提取微量及穩(wěn)定性低的活性組分，這也是本研究能夠在沙棘果中發(fā)現(xiàn)5 種新黃酮化合物的重要原因。UPLC-MS是目前針對(duì)天然產(chǎn)物最常用的手段之一，可研究單體化合物的質(zhì)譜裂解途徑，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。針對(duì)黃酮苷類的質(zhì)譜裂解途徑的研究已經(jīng)較為成熟，可快速鑒定黃酮化合物[27-30]。

本研究所確定的技術(shù)途徑原材料用量較少，分離簡(jiǎn)便，所針對(duì)化合物覆蓋面廣、靈敏度高，特別是能夠分離到含量很低的黃酮類化合物，并且在沒(méi)有相關(guān)黃酮標(biāo)品的情況下也能夠進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，從而系統(tǒng)地完成了沙棘果中黃酮類化合物組分譜分析和結(jié)構(gòu)解析。但由于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的局限性，無(wú)法精確地確定黃酮糖苷所連接的糖苷位置，也無(wú)法準(zhǔn)確判斷五碳糖和六碳糖的同分異構(gòu)體，如木糖和阿拉伯糖以及葡萄糖和半乳糖，還需借助相關(guān)文獻(xiàn)和其他鑒定技術(shù)更好地確定相應(yīng)的化合物。但是，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠快速且方便地進(jìn)行黃酮苷元的分析鑒定，這也是其一大特色。本研究結(jié)果不僅可為沙棘果中的黃酮類天然產(chǎn)物的高值化開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，而且為其他生物資源中天然產(chǎn)物組分譜分析和相關(guān)結(jié)構(gòu)解析提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。