子實(shí)體內(nèi)麥角固醇光轉(zhuǎn)化VD2平菇菌株篩選與培養(yǎng)

徐明芳，陳耕南，沈林燕，王洋洋，李 彥，黃曉晶

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632）

VD是人類和動(dòng)物在成長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的一種維生素，是人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的一種類固醇激素，作為細(xì)胞核類固醇家族成員，具有調(diào)節(jié)人體鈣與磷代謝，影響細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨骼與牙齒的形成，維持血液中氨基酸濃度平衡等作用[1-2]。VD作為固醇類的衍生物，動(dòng)物體內(nèi)VD3或膽鈣化醇由7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射而轉(zhuǎn)變；VD2或鈣化醇則由植物或真菌麥角固醇光轉(zhuǎn)化合成，兩種VD在人體內(nèi)具有相同的生理作用。人體若VD攝取不足，易導(dǎo)致小兒佝僂病、嬰兒手足抽搐癥、軟骨病及老年人骨質(zhì)疏松。2010年流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)老年骨質(zhì)疏松發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家2 倍以上，90%以上老年人群中VD缺乏嚴(yán)重，目前醫(yī)學(xué)研究還表明VD缺乏還是導(dǎo)致癌癥、自發(fā)性免疫疾病、傳染病、心血管疾病和精神疾病等多發(fā)疾病的危險(xiǎn)因素[3-6]。

圖1 麥角固醇（A）和VD2（B）結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of ergosterol (A) and VD2 (B)

麥角固醇是以環(huán)戊烷多氫菲（甾核）為骨架的甾醇類化合物，廣泛存在于食用菌、酵母等真菌中[7-8]，植物中的麥角固醇除非經(jīng)過(guò)紫外光照射合成VD2，否則很難被人體吸收利用[9-11]，麥角固醇與VD2結(jié)構(gòu)式如圖1所示。不同種類食用菌麥角固醇的含量不同，大多數(shù)野生或栽培食用菌都富含麥角固醇，麥角固醇是食用菌中含量最高的甾醇，含量最高達(dá)食用菌干質(zhì)量的0.6%～0.7%，占食用菌中所有甾醇含量的83%～89%[12-15]。麥角固醇經(jīng)紫外光照射時(shí)，分子中一個(gè)碳環(huán)C9和C10發(fā)生斷裂可轉(zhuǎn)化為VD2，麥角固醇是VD2的前體化合物，是很好的VD2來(lái)源，兩者為同分異構(gòu)體[16]（圖1）。

天然食物中VD2含量有限，僅存于野生食用菌、酵母等真菌中，在植物和動(dòng)物中麥角固醇和VD2含量很低[17]。Jasinghe等[18]研究表明，香菇、平菇、雙孢菇和鮑魚菇4 種野生食用菌樣品經(jīng)紫外光照射后，VD2含量隨之變化顯示差異性，其中平菇中VD2含量最高。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%。平菇由于子實(shí)體生長(zhǎng)速度快周期短，是食用菌中產(chǎn)量與消費(fèi)量最高的品種。平菇（Pleurotus ostreatus）屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、側(cè)耳科（Pleurotaceae）、側(cè)耳屬（Pleurotus）[19]，富含多糖、多酚等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[20-22]和降血糖[23-24]等保健功能，目前研究多集中平菇食用菌多糖。麥角固醇是平菇重要的植物甾醇，已引起業(yè)界廣泛關(guān)注，然而，平菇體子實(shí)體內(nèi)麥角固醇光轉(zhuǎn)化為VD2的研究很少。本實(shí)驗(yàn)從5 個(gè)原種菌株搖瓶篩選高產(chǎn)麥角固醇平菇菌株，通過(guò)子實(shí)體培養(yǎng)及其體內(nèi)麥角固醇光促轉(zhuǎn)化為VD2的研究，旨在提高平菇的藥食價(jià)值，為富含維生素食用菌作為原料開發(fā)特膳功能食品的研究提供理論支持，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義及廣泛應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌種（編號(hào)為P10、P40、PL-39、P831、沙白等5 個(gè)平菇菌株） 廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品、VD2標(biāo)準(zhǔn)品、VB1美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉（NaOH）、磷酸二氫鈉、硝酸銨 廣州化學(xué)試劑廠；麥芽糖、乳糖、麩皮、尿素 美國(guó)Amresco公司；蛋白胨、酵母粉 英國(guó)Oxoid公司；葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂（MgSO4）、石油醚、戊二醛、磷酸氫二鈉、四氧化鋨、乙酸異戊酯 天津市大茂化學(xué)試劑廠；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀及數(shù)據(jù)處理平臺(tái) 美國(guó)Agilent公司；HPLC柱COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm） 上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司；Ultra 55 FESEM場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司；Leica EM CPD300CO2全自動(dòng)臨界點(diǎn)干燥儀 德國(guó)Leica公司；SCD 005 Sputter Coater離子濺射儀、UV-1750紫外分光光度計(jì) 日本津島儀器公司；Thermo Scientific超純水儀 美國(guó)Thermo公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化有限公司。

1.3 方法

1.3.1 平菇菌絲體與子實(shí)體培養(yǎng)方法

1.3.1.1 平菇菌種活化

菌種活化固體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g去皮煮汁，加入葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41.5 g、瓊脂粉20 g、VB10.01 g、水1 000 mL。

保藏菌種用接種環(huán)接種于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，菌株菌絲潔白濃密、菌絲爬壁力強(qiáng)及生長(zhǎng)健壯，可作為種子用于后續(xù)搖瓶培養(yǎng)。

1.3.1.2 母種制備與種子搖瓶培養(yǎng)

母種制備與種子搖瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g去皮煮汁，加入葡萄糖20 g、大豆粉2 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB10.01 g、水1 000 mL，常規(guī)分裝，121 ℃高壓滅菌30 min。

母種制備：從PDA培養(yǎng)基中切取潔白健壯的菌絲于250 mL裝有100 mL液體培養(yǎng)基的三角錐瓶中，菌絲生長(zhǎng)最適溫度25 ℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，作為母種待用。

子實(shí)體接種種子制備：從母種中抽取10%接種于500 mL裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角錐瓶中，25 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)6～7 d，作為子實(shí)體接種種子待用。

1.3.1.3 平菇子實(shí)體培養(yǎng)

將稱取好的栽培料200 g（其中棉籽殼86%、麩皮10%、石膏2%、石灰2%）加入適量的水（含水量控制約65%）攪拌均勻裝袋，120 ℃、高壓滅菌2 h；冷卻后無(wú)菌接種，控制溫度22 ℃培養(yǎng)40～60 d，菌絲長(zhǎng)滿栽培袋后分化出菇形成子實(shí)體。

1.3.2 細(xì)胞干質(zhì)量法測(cè)定平菇菌絲體生物量[25]

發(fā)酵液過(guò)濾后，菌絲體用超純水充分洗滌，50 ℃干燥至恒質(zhì)量，電子天平準(zhǔn)確稱質(zhì)量，按下式計(jì)算生物量：

式中：m為細(xì)胞干質(zhì)量/mg；V為取樣體積/L。

1.3.3 樣品中麥角固醇與VD2的提取方法

樣品干燥后碾磨成粉末，取0.1 g于磨口圓底燒瓶中，加入25 mL 15% NaOH溶液、50 mL無(wú)水乙醇及4 mL含抗壞血酸鈉的NaOH溶液（17.5 g抗壞血酸鈉溶于100 mL 1 mol/L的NaOH溶液），85 ℃水浴加熱1.5 h，冷卻至室溫，加入25 mL石油醚，劇烈振蕩，靜置分層，取上清液，復(fù)提下層2 次，合并上清液。上清液中加入5 g無(wú)水硫酸鈉，過(guò)濾。濾液置于45 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，經(jīng)3～4 h蒸至近干，乙醇定容至5 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，上樣待測(cè)。

1.3.4 HPLC檢測(cè)麥角固醇與VD2含量

采用HPLC法同步測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品中麥角固醇及VD2的含量。HPLC的分離條件：色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：100%甲醇；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

準(zhǔn)確量取麥角固醇、VD2標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇稀釋成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)，以麥角固醇、VD2濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算麥角固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.576 6x-15.937，R2=0.999；VD2標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.207x+17.481，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 6。

由HPLC法測(cè)定得到峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到樣品中麥角固醇、VD2濃度，其含量計(jì)算公式如下：

式中：c1、c2分別為麥角固醇、VD2的質(zhì)量濃度；V1、V2分別為麥角固醇、VD2的定容體積；N1、N2分別為麥角固醇、VD2的稀釋倍數(shù)；m1、m2分別為萃取麥角固醇、VD2樣品的干質(zhì)量。

1.3.5 菌絲體搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行顯著因素的篩選，對(duì)葡萄糖（A）、蛋白胨（B）、蔗糖（C）、黃豆粉（E）、MgSO4（G）、KH2PO4（H）和VB1（I）7 個(gè)因素和2 個(gè)虛擬變量[26-28]進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)因素取2 個(gè)水平，高水平（1）、低水平（-1），以平菇菌絲體麥角固醇含量（mg/g）為響應(yīng)值。各因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Levels and factors used for Plackett-Burman design

1.3.5.2 最陡爬坡試驗(yàn)方法

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果中以顯著因素的效應(yīng)大小確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度，為后續(xù)Box-Behnken試驗(yàn)確定中心點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.3.5.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)中確定的顯著因素和中心點(diǎn)，采用Box-Behnken法進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化，以獲取最佳培養(yǎng)基配方，各因素水平設(shè)置見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Levels and factors used for Box-Behnken design

1.3.6 子實(shí)體培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法

每袋200 g子實(shí)體栽培培養(yǎng)基中（1.3.1.4節(jié)）分別調(diào)整葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、豆粉、蛋白胨、KNO3、尿素等組分優(yōu)化子實(shí)體栽培培養(yǎng)基，優(yōu)勢(shì)菌株接種后經(jīng)40 d左右培養(yǎng)分化出菇，分別采集成熟子實(shí)體，在60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，以實(shí)體干質(zhì)量作為子實(shí)體生物量，并測(cè)定麥角固醇含量。

1.3.7 平菇子實(shí)體紫外光照實(shí)驗(yàn)方法

紫外燈（管長(zhǎng)60 cm、功率30 W、波長(zhǎng)254 nm、光照強(qiáng)度0.45 mW/cm2）固定于自行設(shè)計(jì)的光照培養(yǎng)箱架子上，受試物垂直照射距離設(shè)置40 cm。選取子實(shí)體發(fā)育完全、菌蓋未開傘平菇子實(shí)體，分離的菌蓋菌褶與菌柄在不同照射時(shí)間下進(jìn)行紫外光照實(shí)驗(yàn)，非照射處理為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.8 平菇子實(shí)體微觀結(jié)構(gòu)電鏡分析

蒸餾水洗滌樣品3 次，4%戊二醛固定液中固定48 h，0.2 mol/L磷酸緩沖液漂洗3 次，1%四氧化鋨固定2 h，乙醇梯度脫水（分別為30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1 次，100%乙醇2 次，15 min/次），乙酸異戊酯置換乙醇2 次（20 min/次），8 000 r/min離心5 min。制備樣品置于CO2臨界點(diǎn)干燥儀中干燥，離子濺射儀內(nèi)完成80 s噴金處理，采用FEM場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡分析樣品的微觀結(jié)構(gòu)特征。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design Expert 8.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法同步檢測(cè)麥角固醇與VD2技術(shù)方法建立

優(yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)（265、270、280 nm）、流動(dòng)相（甲醇-水比例）、柱溫（25、30、35、40 ℃）和流動(dòng)相流速（0.5～1.2 mL/min）。當(dāng)最佳分離條件確立為波長(zhǎng)270 nm、100%甲醇、柱溫30 ℃、流速1 mL/min、進(jìn)樣量5 μL時(shí)，色譜圖中麥角固醇與VD2單標(biāo)與混標(biāo)色譜峰實(shí)現(xiàn)完全分離（圖2），峰形尖銳對(duì)稱，保留時(shí)間穩(wěn)定，圖譜基線平穩(wěn)，所有樣品在15 min內(nèi)檢測(cè)完畢。

圖2 VD2、麥角固醇單標(biāo)（A）和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（B）HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of vitamin D2 and ergosterol standards

配制6 份相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)麥角固醇、VD2混合溶液在上述優(yōu)化色譜條件下分別進(jìn)樣檢測(cè)，按照測(cè)量值和真實(shí)值計(jì)算回收率，考察該檢測(cè)方法的精密度，結(jié)果見表3所示。樣品麥角固醇、VD2平均回收率分別為99.06%與97.77%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.93%與5.54%。

表3 麥角固醇與VD2的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of ergosterol and VD2 from spiked samples

如圖3A所示，標(biāo)準(zhǔn)品麥角固醇與VD2分別在13.5、10.4 min出峰，峰形尖銳對(duì)稱，基線平穩(wěn)無(wú)干擾。

圖3 麥角固醇與VD2標(biāo)準(zhǔn)品（A）、平菇樣品（B）HPLC譜圖Fig. 3 Chromatograms of standard solutions (A) and P. ostreatus sample (B)

如圖3B所示，平菇樣液中麥角固醇與VD2分別在13.3、10.4 min出峰，峰后有少許雜峰但不影響麥角固醇與VD2的定性定量分析，與圖3A相比。平菇樣品與標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰，主峰與其他色譜峰之間分離關(guān)系良好，表明檢測(cè)體系系統(tǒng)適用性較好，可作為同步檢測(cè)平菇麥角固醇與VD2含量的關(guān)鍵技術(shù)方法。

2.2 高產(chǎn)麥角固醇平菇優(yōu)勢(shì)菌株的篩選

2.2.1 菌絲體的生物量與麥角固醇含量差異性

表4 5 種不同菌株菌絲體的生物量及麥角固醇含量Table 4 Mycelial biomass and ergosterol content of fi ve different strains of P. ostreatus

從表4可看出，5 種平菇菌絲體生物量和麥角固醇含量差異較大，P831和P40菌絲體生物量較高，分別超出均值的20.4%、37.7%，尤其是P831麥角固醇含量可達(dá)3.25 mg/g，高于其他菌株1.0～3.0 倍，說(shuō)明不同菌株對(duì)麥角固醇含量影響較大[23]，P831確定為優(yōu)選菌株。

2.2.2 子實(shí)體生物量與麥角固醇含量差異性

5 株菌株子實(shí)體生物量和麥角固醇含量差異性也較大，結(jié)果如表5所示，與平菇P10、P40、PL-39及沙白菌株相比，P831子實(shí)體中麥角固醇含量最高，可達(dá)到2.05 mg/g。

表5 5 種不同菌株子實(shí)體的生物量及麥角固醇含量Table 5 Fruit body biomass and ergosterol content of fi ve different strains of P. ostreatus

P40雖然生長(zhǎng)快子實(shí)體生物量最高，但其菌絲體與子實(shí)體麥角固醇差異較大，由于菌絲體與子實(shí)體培養(yǎng)時(shí)間約60 d，基于P831在菌絲體與子實(shí)體培養(yǎng)中顯示的穩(wěn)定性最終確定為優(yōu)選菌株。

2.3 平菇菌絲體培養(yǎng)基成分響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 單因素對(duì)菌絲體生物量及麥角固醇含量影響

菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳、氮源是關(guān)鍵成分，碳、氮源是菌體維持細(xì)胞生命活動(dòng)所需的物質(zhì)，提供細(xì)胞能源及各種代謝產(chǎn)物的骨架，構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)、核酸與甾醇等代謝物的材料，對(duì)于菌絲體生物量及麥角固醇含量具有較大的影響。不同碳、氮源對(duì)平菇菌絲體產(chǎn)麥角固醇的影響結(jié)果如圖4所示，其中蔗糖、蛋白胨對(duì)菌絲體麥角固醇含量的影響最大，因此，選擇蔗糖、蛋白胨作為高產(chǎn)麥角固醇的碳、氮源。

圖4 不同碳源（A）、氮源（B）對(duì)平菇菌絲體生物量及麥角固醇含量的影響Fig. 4 Effects of different carbon sources (A) and nitrogen sources (B)on mycelial biomass and ergosterol content of P. ostreatus

2.3.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化平菇菌絲體培養(yǎng)基成分

由表6、7可知，對(duì)平菇菌絲體麥角固醇含量具有顯著影響的組分是蛋白胨、KH2PO4、蔗糖（P＜0.05），而MgSO4、VB1對(duì)平菇菌絲體麥角固醇含量影響具有負(fù)效應(yīng)，確定蛋白胨、KH2PO4及蔗糖為3 個(gè)關(guān)鍵影響因素。

表6 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 6 Experimental results of Plackett-Burman design

表7 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及顯著性分析Table 7 Signi fi cance test of Plackett-Burman design

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)具有正效應(yīng)的3 個(gè)顯著因素蛋白胨、蔗糖、KH2PO4設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，確定菌絲體產(chǎn)麥角固醇液體培養(yǎng)基中關(guān)鍵因素的濃度水平。如表8所示，當(dāng)?shù)鞍纂?.35%、蔗糖3.48%、KH2PO40.35%時(shí)，麥角固醇最大響應(yīng)值為3.324 mg/g。

表8 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Experimental results of steepest ascent path design

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以麥角固醇含量為響應(yīng)變量Y，以蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.35%（X1）、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5%（X2）、KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.35%（X3）為Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化菌絲體高產(chǎn)麥角固醇液體培養(yǎng)基組分。不同液體培養(yǎng)基組成對(duì)菌絲體麥角固醇含量的影響結(jié)果如表9所示。

對(duì)表9中菌絲體麥角固醇含量進(jìn)行回歸分析，以麥角固醇含量為響應(yīng)變量Y，以蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X2）、KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X3）為自變量X的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=3.53-0.055X1-0.018X2-0.011X3+0.26X1X2+0.079X1X3-0.045X2X3-0.45X12-0.45X22-0.56X32

由表10方差分析結(jié)果可知，二元回歸模型具有極顯著性（P＜0.01極顯著），失擬誤差P=0.023 7（P＜0.05顯著），回歸方程和擬合度置信度均較高。

表9 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 9 Experimental results of Box-Behnken design

表10 回歸模型的方差分析Table 10 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

通過(guò)對(duì)回歸模型分析知，響應(yīng)面法優(yōu)化平菇P831菌絲體產(chǎn)麥角固醇的培養(yǎng)基最佳配比為蛋白胨0.35%，蔗糖3.48%，KH2PO40.35%。在此條件下，模型預(yù)測(cè)平菇菌絲體中麥角固醇含量達(dá)3.53 mg/g, 而實(shí)測(cè)值為3.64 mg/g，相對(duì)誤差為2.995%，驗(yàn)證了響應(yīng)面法預(yù)測(cè)模型所得結(jié)果的可靠性，表明在此條件下該模型具有可預(yù)測(cè)性。

2.4 栽培料中碳、氮源對(duì)子實(shí)體生物量與麥角固醇含量的影響

每袋200 g子實(shí)體栽培料中，不同碳、氮源量對(duì)子實(shí)體生物量與麥角固醇含量的影響如圖5所示，與對(duì)照組（CK）相比，添加了KNO3、葡萄糖、豆粉、尿素的培養(yǎng)基有利于子實(shí)體的生長(zhǎng)，其中KNO3對(duì)子實(shí)體產(chǎn)生物量影響最大，而當(dāng)栽培料中添加蛋白胨、麥芽糖時(shí)，子實(shí)體生物量相對(duì)較低（圖5A）。

圖5 栽培料對(duì)子實(shí)體生物量（A）與麥角固醇含量（B）的影響Fig. 5 Effects of different medium components on biomass and ergosterol content of fruit body

由圖5B可知，添加尿素、蔗糖與豆粉的培養(yǎng)基可增加子實(shí)體中麥角固醇的含量，其中尿素影響最大，此時(shí)麥角固醇含量最高達(dá)3.81 mg/g，而蛋白胨、葡萄糖、KNO3、麥芽糖對(duì)子實(shí)體麥角固醇的含量影響不大。

2.5 平菇子實(shí)體內(nèi)麥角固醇光轉(zhuǎn)化VD2

子實(shí)體是平菇的繁殖器官，基本結(jié)構(gòu)由菌蓋菌褶與菌柄組成。對(duì)平菇子實(shí)體不同部位經(jīng)紫外光照射處理，菌蓋菌褶與菌柄中麥角固醇與VD2含量結(jié)果如表11所示。

表11 平菇不同部位麥角固醇光化VD2含量差異性Table 11 Ergosterol and vitimin D2 contents in different fruit body parts of P. ostreatus

平菇未經(jīng)紫外照射的情況下，菌蓋中麥角固醇含量高于菌柄，此時(shí)均未檢測(cè)到VD2；經(jīng)過(guò)20 min的紫外照射后，菌蓋和菌柄中均檢測(cè)到VD2，其中菌蓋中麥角固醇及VD2含量均高于菌柄，雖然菌蓋、菌柄中麥角固醇含量變化不明顯，但VD2卻有顯著變化，這與麥角固醇經(jīng)紫外照射轉(zhuǎn)化為VD2有關(guān)[29]。

食用菌體中麥角固醇光促轉(zhuǎn)化為VD2反應(yīng)機(jī)理如圖6所示，紫外光照射對(duì)麥角固醇光轉(zhuǎn)化VD2有顯著影響，麥角固醇是真菌細(xì)胞膜中的重要組成成分，共有15 個(gè)酶反應(yīng)參與其生物合成代謝途徑[30]，紫外光轉(zhuǎn)化過(guò)程中主要產(chǎn)物的相互關(guān)系[31]。

圖6 麥角固醇紫外光轉(zhuǎn)化VD2示意圖[31]Fig. 6 Schematic illustration of UV-induced transformation of ergosterol into VD2

圖7 平菇不同部位掃描電鏡圖Fig. 7 Morphological characteristics of different fruit body tissues of P. ostreatus observed by FESEM

麥角固醇在光催化反應(yīng)中，除生成有活性的VD2前體和VD2外，長(zhǎng)時(shí)間的紫外光照，還會(huì)生成多種無(wú)效價(jià)的同分異構(gòu)體，如光甾醇（L）和速甾醇（T）等副產(chǎn)物[29,32]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)麥角固醇與VD2含量之間轉(zhuǎn)化的相關(guān)性研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，光照射時(shí)間40 min以上，平菇色澤出現(xiàn)由白向深黃褐的轉(zhuǎn)變，說(shuō)明子實(shí)體組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)光損傷，對(duì)于平菇而言，將嚴(yán)重影響其外觀。

麥角固醇是真菌細(xì)胞膜中的重要組成成分，大量存在于食用菌細(xì)胞質(zhì)膜上，多以自由態(tài)存在于真菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中。圖7電鏡結(jié)果顯示，平菇子實(shí)體菌蓋中含有大量菌絲體與成喙?fàn)钔黄鸬逆i狀結(jié)構(gòu)，菌蓋菌褶中致密的菌絲孢子和菌柄中管狀纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（未見孢子）這兩種組織結(jié)構(gòu)存在微觀差異性，平菇中麥角固醇與VD2含量從上面菌蓋菌褶到下面菌柄呈遞減趨勢(shì)，而平菇食用菌絲體中鎖狀結(jié)構(gòu)和子實(shí)體中孢子是細(xì)胞分裂能力、新陳代謝旺盛的主要組織結(jié)構(gòu)，推測(cè)麥角固醇與VD2含量與組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞新陳代謝能力有相關(guān)性。

3 結(jié) 論

5 個(gè)篩選的實(shí)驗(yàn)菌株中，菌株P(guān)831麥角固醇含量高于其他菌株1.0～3.0 倍，確定為優(yōu)勢(shì)菌株。

響應(yīng)面法優(yōu)化平菇菌絲培養(yǎng)基關(guān)鍵組分，當(dāng)菌絲培養(yǎng)基中蛋白胨為0.35%、蔗糖為3.48%、KH2PO4為0.35%時(shí)，平菇P831菌絲體麥角固醇含量達(dá)到3.64 mg/g，與回歸方程預(yù)測(cè)值3.5 mg/g相比，相對(duì)誤差為2.995%。

子實(shí)體培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，尿素有促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)及提高麥角固醇含量作用。

平菇子實(shí)體不同組織結(jié)構(gòu)中VD2含量在紫外光作用下有較大的差異，菌蓋菌褶中麥角固醇與VD2含量明顯高于菌柄，電鏡結(jié)果顯示菌蓋菌褶中致密的菌絲孢子和菌柄中管狀纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的微觀差異性，推測(cè)麥角固醇與VD2含量差異與組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞新陳代謝能力有關(guān)。